嫩度是决定肉食用品质的一个重要指标,成熟是改善肉嫩度的有效途径之一。传统的理论认为宰后嫩度的改善主要归因于钙激活酶对部分肌原纤维蛋白的有限降解,然而钙激活酶并不能解释所有的宰后嫩度变化规律,如在钙激活酶抑制剂或钙离子络合剂存在条件下,仍有部分肌原纤维蛋白发生了降解。因此,有学者提出成熟是多种内源酶共同作用的结果,除钙激活酶外,细胞凋亡酶也可能参与成熟过程。已有的研究结果表明动物被屠宰、放血后,骨骼肌细胞以凋亡的形式死亡,凋亡效应酶3也能够在宰后早期被激活,这为进一步研究细胞凋亡酶是否参与成熟过程提供了理论前提。本论文主要研究凋亡效应酶3对牛肉肌原纤维蛋白的降解情况、牛肉成熟过程中凋亡效应酶与钙激活酶之间的相互作用、宰后牛肉肌细胞凋亡相关因子的表达及凋亡通路、Ca2+和Zn2+对宰后牛肉成熟过程中细胞凋亡酶及相关凋亡因子的影响,通过以上研究可以为进一步完善宰后肌肉成熟机制提供理论依据。具体研究内容和结果如下：1凋亡效应酶3和钙激活酶抑制剂对宰后牛肉肌原纤维蛋白降解的影响本部分试验主要通过使用细胞凋亡效应酶3的专一性抑制剂Ac-DEVD-CHO和钙激活酶抑制剂MDL-28170对宰后牛肉进行处理,然后借助SDS-PAGE和免疫印迹技术检测主要细胞骨架蛋白的降解情况。结果表明钙激活酶抑制剂MDL色够在宰后的14天内显著抑制(P<0.05)伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白的降解及肌钙蛋白-T的28-30kDa特征降解产物的生成；凋亡效应酶3的抑制剂DEVD只能在宰后的早期显著抑制(P<0.05)这些蛋白的降解。MDL能够明显抑制宰后牛肉中钙激活酶的活性,这说明MDL对细胞骨架蛋白降解的抑制主要是通过钙激活酶实现的；DEVD对钙激活酶活性没有显著影响,这可以进一步排除钙激活酶的干扰。综上所述,钙激活酶是宰后牛肉肌原纤维蛋白降解的主要贡献者,细胞凋亡效应酶3在牛肉成熟的早期参与细胞骨架蛋白的降解,从而改善宰后嫩度。2细胞凋亡效应酶3和6对牛肉肌原纤维蛋白的体外降解本部分试验主要研究细胞凋亡效应酶3和6是否能够在体外降解牛肉肌原纤维蛋白,以及这些降解变化是否与宰后牛肉成熟过程中这些蛋白的变化相一致。结果表明凋亡效应酶3和6能够在体外完全模拟自然成熟条件下伴肌球蛋白和伴肌动蛋白的降解变化；凋亡效应酶3和6能够降解肌钙蛋白-T,但只能够模拟宰牛肉成熟过程中肌钙蛋白-T的28kDa的降解产物；凋亡效应酶3不能够在体外降解牛肉肌间线蛋白,凋亡效应酶6能够在体外引起肌间线蛋白的显著降解,生成45、29和27kDa的降解片段,但只有45kDa的降解产物在宰后牛肉成熟过程中出现。因此凋亡效应酶3和6只能在宰后牛肉成熟的早期参与伴肌球蛋白和伴肌动蛋白的降解,从而改善宰后嫩度。3宰后牛肉成熟过程中calpastatin的降解机制研究本部分试验主要研究细胞凋亡效应酶3和微摩尔钙激活酶对宰后牛肉成熟过程中calpastatin的降解作用,以调查牛肉成熟过程中细胞凋亡酶和钙激活酶系统之间的相互作用。结果表明钙激活酶抑制剂MDL能够在宰后的3天内抑制calpastatin的降解；凋亡效应酶3抑制剂DEVD能够在宰后的1天内抑制calpastatin的降解。微摩尔钙激活酶在体外能够完全模拟牛肉成熟过程中calpastatin的降解变化,使其生成100和70kDa的两条降解产物；凋亡效应酶3在体外也能够降解牛肉calpastatin,但只能模拟出现牛肉成熟过程中calpastatin的100kDa降解产物；凋亡效应酶6在体外也能够降解牛肉calpastatin,但降解产物完全不同于牛肉成熟过程中calpastatin勺降解产物。凋亡效应酶3只能在宰后的早期具有活性作用,因此凋亡效应酶3只能在宰后早期参与calpastatin的降解,钙激活酶是calpastatin降解的主要贡献者；凋亡效应酶3对calpastatin的降解有助于钙激活酶的激活,但钙激活酶可以阻止凋亡效应酶发挥作用。4宰后牛肉成熟过程中细胞凋亡酶及相关凋亡因子的变化本部分试验主要通过调查宰后牛肉成熟过程中细胞凋亡酶及相关凋亡因子的表达变化,以探讨宰后牛肉骨骼肌细胞凋亡的通路(凋亡效应酶的激活路径)。结果显示宰后牛肉成熟过程中凋亡效应酶3能够被激活。同时在宰后早期,线粒体中的细胞色素c减少,而胞浆中的细胞色素c增多,这说明在宰后早期细胞色素c从线粒体中被释放到胞浆中。抗凋亡因子Bcl的表达在牛肉成熟过程中没有明显变化；促凋亡因子Bax在成熟过程中的表达量上升；而HSP27的表达量随宰后时间的延长逐渐减少,尤其在宰后的前6小时。这些结果表明,线粒体通路是宰后牛肉骨骼肌细胞发生凋亡的一种重要路径,Bax和HSP27是宰后牛肉肌细胞发生凋亡的关键调节因子。5Ca2+、Zn2+处理对宰后牛肉成熟过程中细胞凋亡酶3及相关凋亡因子表达的影响本部分试验通过使用Ca2+、Zn2+对宰后牛肉进行处理,然后检测细胞凋亡效应酶3及相关凋亡因子是否发生变化,从而调查细胞凋亡酶是否是Ca2+、Zn2+对宰后牛肉嫩度影响的一个途径。结果显示Ca2+加速了凋亡效应酶3的激活,Zn2+抑制了该酶的激活。Ca2+提高细胞色素c的表达,而Zn2+对细胞色素c的表达没有显著(P＞0.05)影响。因此,Ca2+可能通过调控上游凋亡通路上的凋亡因子而间接加速凋亡效应酶3的激活；而Zn2+对凋亡效应酶3的抑制作用可能是通过直接作用于该酶而实现的。Ca2+和Zn2+对宰后牛肉嫩度的影响除了通过钙激活酶来实现外,也可能通过细胞凋亡酶来实现。