研究背景胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是目前中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,患者整体中位数生存时间仅约15个月。目前该疾病的治疗方案主要为手术切除结合术后化疗及放疗。在临床化疗用药中,以替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)的应用最为广泛。药理学研究显示,替莫唑胺是一种DNA烷化剂,通过对胶质瘤细胞DNA片段进行破坏性修饰,促使肿瘤细胞趋于凋亡或坏死。然而,在治疗过程的中后期,部分患者对替莫唑胺的敏感性逐渐降低,疾病根治难度逐渐增大。因此,有效的保持神经胶质瘤患者对替莫唑胺的敏感性至关重要。研究表明,替莫唑胺耐药的形成主要与两个蛋白酶活性增强有关：即甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶和核酸错配修复蛋白酶。此外,与之相关的蛋白还包括谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)、DNA核酸剪切修复酶(nucleotide excision repair, NER)、多药耐药性蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1, ABCB1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, bcl-2)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)等等。然而,目前越来越多的实验结果显示：有效控制上述单个或几个蛋白酶活性后,部分胶质瘤细胞对替莫唑胺仍表现出较高的耐受性。提示替莫唑胺耐药是一个多分子参与的复杂过程,对其机制进行更加深入的研究极有必要。长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNAs)是一种转录长度超过200bp,无蛋白编码功能的核酸序列。目前研究表明, lncRNAs在调节细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成中发挥重要功能。越来越多的研究表明,lncRNAs参与肿瘤细胞的形成和发展。例如,在肝癌、白血病、肺腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌组织中均发现lncRNAs差异性表达。LncRNA与肿瘤化疗耐药性的相关研究也日益受到重视,有研究发现,在骨肉瘤细胞中,lncRNAs (ENST00000563280,nr-036444)通过调控ABCB1、低氧诱导因子-1A(Hypoxia inducible factor-1, HIF-1A)和人叉头框蛋白(Forkhead box protein C2, FOXC2)等活性,在化疗药物多柔比星的耐药形成中发挥重要作用。LncRNA UCA1 (urothelial cancer associated 1)通过激活Wnt信号通路,增强膀胱癌细胞对顺铂的耐受性。此外,在原发性肉瘤中,lncRNA HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)表达水平与化疗敏感性呈正相关性。因此,有学者提出在基因水平调控lncRNAs,可能是降低脑胶质瘤化疗耐药的新策略。目前已经有研究者针对术后接受替莫唑胺化疗的脑胶质瘤患者进行随访,并将胶质瘤复发患者组织与首次胶质瘤手术切除组织进行lncRNAs基因芯片分析,结果显示：约1000多个lncRNAs存在差异性表达,提示lncRNAs极有可能参与替莫唑胺耐药性的形成,并在此过程中发挥重要作用。最近研究显示,lncRNAs可作为竞争性内源RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA),参与调控肿瘤细胞的多个生物学功能。LncRNAs可作为天然的海绵支架与多个miRNAs结合,从而对]miRNAs下游靶点进行转录后水平调控。例如lncRNA NEAT1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1)可通过减弱miR-449b对靶基因c-Met的抑制作用,促进神经胶质瘤发生发展。LncRNA H19过表达后,通过与miR-675相互作用,促使miR-675靶基因TGF-β1蛋白含量上调,诱导成骨细胞分化。此外,lncRNA UCA1通过抑制miR-216b活性,激活FGFR1/ERK信号通路,抑制肝癌恶性进展。然而,此机制是否存在于lncRNAs对脑胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性的调控,还有待研究。在本研究中,首先构建胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞株U87TR和U251TR。通过基因芯片技术,筛选耐药细胞株U87TR与亲本细胞株U87之间差异性表达的lncRNAs,通过生物信息学分析,选定lncRNARP11-838N2.4为本研究的关键lncRNA。验证其对胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性的调控作用,并探讨其可能机制。材料和方法1.人脑胶质瘤标本收集收集自2014年1月—-2015年6月期间南方医科大学第二临床医学院神经外科收治脑胶质瘤患者手术切除标本53例,整理临床资料并进行术后随访。标本切除后送病理科,按病理诊断设定纳入标准。按WHO脑胶质瘤分级标准,其中I级2例,II级10例,III级3例,Ⅳ级38例。在IV级38例受试患者中,所有患者术后均接受替莫唑胺化疗处理,其中23例患者在1年内复发。所有组织标本在手术切除后立即置于液氮中保存。本研究经南方医科大学第二临床医学院伦理委员会批准,所有受试患者均以书面形式告知并签署知情同意书。2. RT-PCR法检测lncRNAs, miRNAs和mRNAs将组织样本或细胞样本采用Trizol法提取RNA。按说明书要求将一般RNA反转录为cDNA; miR-10a的检测采用miRNAs Qpcr Quantitation Kit试剂盒(富能基因公司),mRNAs与lncRNAs均采用RT-PCR试剂盒(Takara公司), mRNAs以GAPDH为内参,lncRNAs和miRNAs以U6为内参。按20ul体系配制成混合液后,置于ABI 7500仪器运行,取三次独立实验所得数据均数为结果。引物序列见下表：RT-PCR中的引物序列3. Western blotting法细胞/组织蛋白提取后,BCA法测蛋白浓度。配10%分离胶行SDS-PAGS电泳,转膜后依次孵育一抗、二抗。EphA8、TGFβ1、smad2和smad4抗体均来自CST公司,β-action抗体源于中彬金桥,以β-action为内参。将胶片扫描,用凝胶图像处理系统分析目的条带光密度值及分子量,完成统计分析。4.CCK-8法待细胞在对数生长期时,用0.25%胰酶短暂消化,接种于96孔板。按细胞正常生长周期及速度计算接种细胞量,每孔1500～2000个细胞为宜。每组6-8个副孔,待12h细胞完全贴壁后,将待测样本每孔加入CCK8试剂10ul,放入细胞培养箱孵育3h,分别在24h,48h,72h,96h和120h时间点用酶标仪检测待测孔A450处吸光度值。并绘制细胞增殖曲线。每组至少重复检查3次。5.流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡取对数生长期细胞,转染lncRNA或阴性对照,只加lipofectamine 3000组设为空白对照组,每个中皿培养体系为3ml。收集细胞后,采用400ul Binding Buffer重悬细胞。每管细胞样本加入等比例的Annexin V-FITC与Propidium Iodide3-5ul,可根据细胞数量多少适当调整。室温下避光反应10～15分钟后冰上放置。振荡混匀,无明显细胞团块情况下上流式细胞仪检测。6. TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法取对数生长期细胞,调整细胞比例为20～30%,制作细胞爬片。4%多聚甲醛固定后,采用1%Triton-X液处理。待细胞通透性改变后,依次将样本置于TdT酶反应液、Streptavidin-TRITC反应试剂处理后,滴加含有DAPI的甘油封片剂,室温下避光反应15-20分钟后,荧光显微镜下观察。7.裸鼠成瘤实验选4周龄BALB/C裸鼠,在SPF级别环境下培养。分别在左侧／右侧皮下注射入胶质瘤细胞。细胞皮下注射后每3-5天测量一次瘤体直径,估算肿瘤体积。待5-6周或荷瘤小鼠出现死亡时,处死小鼠,拍照、皮下分离肿瘤,统计其体积和重量。8.荧光素酶报告首先psiCHECK-2-lncRNA-3’UTR-R载体构建后,行PCR扩增反应,PCR产物胶回收分离纯化。待电泳结束后,将DNA琼脂糖块置于水平透亮玻璃板,在紫外灯指引下,切除目的琼脂糖片段。将切除的胶带转移至高压灭菌处理过的1.5ml EP管中。按1.2ul融化液对应lmg琼脂糖胶带比例,向1.5ml EP管中加入DR-I Buffer缓冲液。将菌落(wt-lncRNA)提交于广州锐博生物公司进行检测,后续检测结果将在NCBI数据库进行BLAST分析后,采用lipofectamine3000阳离子脂质体法对人脑胶质瘤细胞进行转染。将pisCHECK-2-lncRNA-3’UTR-R, lncRNA-3’UTR-mut、pisCHECK-2转染至人脑胶质瘤细胞；共转染miR-10a minics、anti-miRs或miR-control;细胞裂解后上机检测荧光素酶活性强度。Luciferase活性检测原则上参考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910荧光酶活性检测说明书,适当做调整。将萤火虫荧光素酶的荧光值进行归一化(海肾荧光素酶荧光值),每组实验重复3次,取平均值进行后统计分析。9.免疫组化将脑胶质瘤组织置入组化石蜡包埋缸中进行石蜡包埋后,切除组织。将载玻片用75%酒精消毒,并擦拭干净后,垂直置入恒温展片箱中,使组织切片与载玻片紧密贴附。尽量避免组织皱褶及中间夹层气泡形成。将组织切片脱蜡10分钟。确保脱水后和抗原修复后,在载玻片上滴加正常非免疫动物血清1滴,将载玻片按预设分组分阴性对照组和阳性对照组。在载玻片上依次滴加一抗、二抗,并在载玻片上滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液一滴,完成后滴加预先配制好的DAB显示液,室温下水平放置孵育6分钟,倒置显微镜下观察。去除DAB显示液,用苏木精染色10～15秒,完成后立即完成盐酸酒精分化,氨水返蓝。按预先设定的乙醇梯度及作用时间,将载玻片进行乙醇脱水干燥,待其自然晾干后用进行载玻片封闭。显微镜下观察。10.过表达质粒或si-lncRNA转染人脑胶质瘤细胞-脂质体(lipofectamine 3000)法本研究中利用过表达质粒或RNA干扰片段(siRNA)改变lncRNAs细胞内含量。在转染后的人脑胶质瘤细胞中,通过在细胞培养基中滴加链霉素筛选慢病毒阳性转染细胞。本研究中所用的过表达质粒及siRNA干扰质粒由广州锐博公司合成,按照预先设定分组,lncRNAs RT-PCR检测lncRNAs表达情况,进行后续实验。11.统计分析所有数据资料用SPSS21.0软件统计分析。计量资料以均数±标准差显示,两组间样本比较采用独立样本t检验,多组间样本比较采用单因素方差分析。所有计量资料计算P值前检验方差齐性。所有实验重复3次cLncRNA RP11-838N2.4与miR-10a表达水平相关性用Pearson法分析。临床样本中,GBM患者生存时间与lncRNA RP11-838N2.4表达水平采用log rank分析。设置P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.构建胶质瘤耐药细胞株U87TR和U251TR并验证其对替莫唑胺的耐药性首先通过亲代GBM细胞系U251和U87构建TMZ耐药细胞株U251TR和U87TR。CCK-8结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,U87TR和U251TR细胞增值能力高于比亲本U87和U251细胞。半数抑制浓度(IC50)结果显示：U87TR细胞IC50为289.53±5.54 ug/ml,是U87细胞(98.104±2.63 ug/m1)的2.95倍；U251TR细胞IC50为269.57±16.98 ug/ml,是U251细胞(109.48±1.82 ug/ml)的2.46倍。同时,流式细胞仪结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,细胞培养48小时后,U87+TMZ的细胞凋亡率为20.42%+0.52%,是U87TR+TMZ(5.86%±1.17%)的3.49倍；U251+TMZ的细胞凋亡率为19.05%+3.04%,是U251TR+TMZ(7.65%±0.87%)2.49倍,差异具有统计学意义。2. LncRNA RP11-838N2.4在TMZ耐药细胞株U87TR及U251TR中低表达基因芯片分析提示：lncRNA RP11-838N2.4 (ENST00000581442)在U87TR细胞中较U87细胞下调7.65倍(p值=0.0002299)。RT-PCR结果显示：lncRNARP11-838N2.4在TMZ耐药细胞株U251TR及U87TR中的表达水平低于U251和U87细胞,差异具有统计学意义。3. LncRNA RP11-838N2.4与脑胶质瘤患者预后存在相关性对比15例原发性胶质母细胞瘤患者和23例复发性患者组织样本,RT-PCR结果显示：lncRNA RP11-838N2.4在复发组中表达水平低于原发性脑胶质瘤组织。临床资料显示：lncRNA RP11-838N2.4表达水平与胶质瘤病理级别呈正相关性(P=0.001),与患者性别或年龄无关。Kaplan meier描述分析显示：lncRNARP11-838N2.4表达水平高的GBM患者存活时间超过表达水平较低的患者(p=0.032)。4.上调lncRNA RP11-838N2.4可增加U87TR和U251TR对TMZ的敏感性LncRNA原位杂交实验证实：lncRNA RP11-838N2.4主要位于细胞质中。在U87TR和U251TR细胞中,转染pcDNA-lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-RP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)。CCK-8结果显示：pcDNA-RP组细胞对TMZ的敏感性高于pcDNA-NC对照组；pcDNA-RP组细胞IC50值低于对照组；流式细胞仪和TUNEL结果均显示：U87TR和U251TR中,pcDNA-RP组细胞凋亡比例均高于pcDNA-NC组。差异具有统计学意义。将U87TR细胞转染lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-RP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)后,分别接种于裸鼠皮下。同时接受TMZ 50 ug/g或PBS尾静脉注射治疗,结果显示：TMZ 50ug/g尾静脉治疗组中,pcDNA-RP组细胞皮下肿瘤增长速度低于pcDNA-NC.接种5周后,U87TR细胞pcDNA-RP组肿瘤的平均重量为217±17mg,pcDNA-NC组肿瘤的平均重量为592+32mg；pcDNA-RP组肿瘤重量及体积低于pcDNA-NC组,差异具有统计学意义。5. LncRNA RP11-838N2.4下调miR-10a表达并减弱miR-10a对靶基因的抑制在U87TR和U251TR细胞分别转染lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-IRP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)后。RT-PCR结果显示：miR-10a在pcDNA-RP组细胞中,表达含量低于pcDNA-NC组。胶质瘤组织样本结果显示：miR-10a在复发型组织中表达量高于原发性组织。RNAhybird2.0序列分析结果显示：野生型序列lncRNA RP11-838N2.4与miR-10a"seed"区存在碱基互补。荧光素酶结果证实pMIR-lncRNA RP11-838N2.4-wt中,miR-10a组相对荧光素酶含量低于miR-control组。Western blotting结果表明：U87TR和U251TR细胞中,EphA8为miR-10a靶基因。miR-10a与pcDNA-RP共转染组EphA8蛋白含量高于与miR-10a+pcDNA-NC组。差异均具有统计学意义。6. LncRNA RP11-838N2.4通过抑制miR-10a活性,参与调控GBM细胞TMZ耐药性U87TR和U251TR过表达miR-10a后,分别转染pcDNA-RP或pcDNA-NC。CCK-8结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,miR-10a+pcDNA-RP组细胞增殖能力低于miR-10a+pcNA-NC组。miR-10a+pcDNA-RP组细胞IC50低于miR-10a+pcDNA-NC组。流式细胞仪和TUNEL结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,miR-10a+pcDNA-RP组细胞凋亡比例高于miR-10a+pcDNA-NC组。差异均具有统计学意义。7. LncRNA RP11-838N2.4抑制TGFβ信号通路部分蛋白表达U87TR和U251TR细胞过表达lncRNA RP11-838N2.4后,western blotting结果显示：pcDNA-RP组细胞TGFβ1和smad2蛋白含量低于pcDNA-NC组,差异均具有统计学意义。结论1. LncRNA RP11-838N2.4表达含量与胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性为负性相关。GBM患者lncRNA RP11-838N2.4表达水平越低,复发率越高,预后越差。2. LncRNA RP11-838N2.4与miR-10a"seed"区域存在碱基互补,负性调控细胞miR-10a的表达含量,对miR-10a下游靶基因EphA8的mRNA及蛋白水平均表现为正性调控作用。3. LncRNA RP11-838N2.4可作为ceRNA,通过结合miR-10a,参与调控胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药。综上所述,长链非编码RNA RP11-838N2.4可作为ceRNA,通过调控miR-10a活性参与脑胶质瘤替莫唑胺耐药性的形成。