研究背景类风湿性关节炎（RA）是一种常见的结缔组织病,呈全球性分布,在我国的患病率约为0.32%～0.36%,专家估计目前我国RA患病人数约500万,如此庞大的RA患病人群,给我国社会、经济造成巨大的损失,也是导致劳动者丧失劳动力和致残的主要病因之一。目前RA的病因和发病机制仍不甚清楚,相关因素较多,研究表明基因遗传因素的作用约占60%。以往有关RA基因遗传因素的研究主要集中在主要组织相容性抗原复合物（major histocompatibilitycomplex,MHC）的研究方面,约占其发病遗传风险的三分之一。由于全基因组扫描、基因芯片等技术的不断发展,有关在MHC以外区域与不同研究背景人群RA发病有关的易感基因不断被发现,如肽基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase type 4,PADI4）、溶质转运蛋白SLC22A4基因（solute carrier family 22 members 4,SLC22A4）,可结晶片段受体样因子3（FCRL3）、转录激活因子4（STAT4）基因及PTPN22等,而PTPN22是目前公认的除MHC之外与自身免疫性疾病发病相关的最重要的危险因子,其基因多态性研究已成为RA发病及其易感性研究中的热门焦点之一。PTPN22基因位于染色体1p13.3-13.1,包含16个外显子和15个内含子,其编码的淋巴酪氨酸磷酸酶（Lyp）属于酪氨酸磷酸酶（Ptps）家族。目前研究较多的位点是PTPN221858 C→T基因的突变,其主要致病机制文献报道认为是精氨酸突变为色氨酸后破坏了Lyp与Src酪氨酸激酶C端（Csk）的紧密结合,潜在改变了Lyp作为T细胞活性负调节剂的正常功能,导致T细胞活性增强,免疫稳态遭到破坏,从而诱发自身免疫性疾病的发生。虽然有大量文献报道PTPN22 1858 C→T的单核苷酸多态性（SNP）与多种自身免疫性疾病的发病有关,但是都主要集中在欧美白种人群,在亚洲黄种人及非洲黑人发生的频数几乎为0,研究认为这一SNP位点的发生存在明显的遗传异质性。2006年日本学者Kawasaki等通过基因测序发现PTPN22基因存在五个新的SNP位点,其中启动子区域的-1123G→C SNP与亚洲人群（日本及韩国人）急性发作型Ⅰ型糖尿病（TID）发生密切相关,认为此位点是除C1858T SNP之外又一个与自身免疫性疾病发病相关、出现频率较高的突变位点。鉴于PTPN22-1123G→C SNP与亚洲人群（日本及韩国人）急性发作型Ⅰ型糖尿病（TID）的发生密切相关以及中国人群同属亚洲黄种人,与日本及韩国人具有相似的遗传背景,我们推测PTPN22-1123 G→C SNP与自身免疫性疾病RA的发病具有相关性。为此,本论文以中国广东汉族RA人群为主要研究对象,采用高效液相色谱分析（denaturing high performance liquidchromatography,DHPLC）与DNA测序相结合及聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）分析法与DNA测序相结合的检测技术,研究中国广东汉族RA患者PTPN22-1123 G→C基因多态性与RA发病的相关性及PTPN22 1858 C→T SNP在中国广东人群中的发生频率,同时采用荧光定量PCR技术对PTPN22基因的表达进行相对定量,了解G-1123C SNP对RA患者PTPN22基因表达的影响,为探讨RA的发病机制及临床早期诊断提供实验室的理论依据。研究方法1研究对象RA组为2007年3月～2008年12月在南方医科大学附属南方医院就诊的门诊无血缘关系RA病人,其诊断依据为美国大学1987年修订的类风湿学诊断标准。RA患者148人,男性27人,女性121人,其中湖南籍10人,江西4人,福建省3人,贵州1人、河南省1人,广东129人。对照组为无血缘关系的同期医院门诊健康体检者。男性41人,女性111人,广东省152人。两组均为汉族,排除其它自身免疫性疾病和严重心、肝、肾疾病。2研究方法2.1酚—氯仿法抽提DNA,设计特异性引物,PCR扩增目的片段。2.2采用PCR-RFLP,结合DNA测序技术检测PTPN22基因C1858T多态性。2.3采用DHPLC法,结合DNA测序技术检测PTPN22基因G-1123C多态性。2.3运用SPSS13.0进行二分类的Logistic回归分析,以所有个体是否发病为因变量Y,年龄、性别为自变量X进行分析,观察去除性别、年龄因素后各基因型与RA患者发病的相关性。根据RA病人X线检查是否出现关节损伤、RF的阴阳性、发病起始年龄的临床特征,将RA患者分为六组,并与健康对照组分别进行比较,分析G-1123C SNP位点的发生与各临床特征之间的相关性。2.4收集148例RA患者,均为临床确诊病人,其中52名患者临床特征资料完整齐全,按照RA患者-1123 SNP位点基因型的不同,将52名RA患者分为突变杂合子（GC型）RA组、突变纯合子（CC型）RA组、以及野生型（GG型）RA组三个不同组别,分别对三组间RA患者的各个临床特征进行统计分析,观察三组不同基因型RA患者的临床特征间有无统计学差异。2.5采用SYBR Green荧光染料定量PCR检测所有突变病人组及健康对照组PTPN22基因的表达量,以GAPDH管家基因为内参基因,采用△CT法计算,运用独立样本t检验进行统计学分析,观察两组样本PTPN22基因的表达量是否存在统计学差异。以2^-△△CT法计算两组表达量的差别。2.6统计方法采用基因计数法计算PTPN22两个SNP位点基因型频率和等位基因频率:各组间基因型和等位基因分布比较采用SPSS13.0统计软件进行Pearson x²检验;运用二分类logistic回归分析去除性别和年龄因素的影响,以了解各基因型与RA发病相关的OR值。携带C基因与RA临床特征的相关性分析,以Pearsonx²检验逐一分析。以X±s表示样本的均数,两样本均数的比较采用t检验,两个独立样本率的比较采用x²,多个样本均数的比较采用one-way ANOVA,多个样本率的比较采用多个独立样本非参数检验,定义双侧P＜0.05为有统计学差异。结果1、PTPN22 G-1123C位点与中国广东汉族人群RA的发病有关,RA病人组与对照组PTPN22 G-1123C SNP基因型的发生频数存在差异（P=0.016）;两组间携带C突变基因的频数有显著性差异（P=0.000;OR,1.837;95%CI,1.328～2.541）。logistic回归分析进一步提示:去除性别及年龄的影响因素后,两组间基因型频率仍存在差异（P=0.021）,其中突变杂合子GC型与RA的发病明显相关（P=0.006;OR,2.051;95%CI,1.234～3.410）。2、PTPN22基因C1858T多态性在中国广东地区汉族人群中发生的频率为0,C1858T SNP位点与中国广东汉族人群RA的发病无关,所检测的148例RA患者及151例健康对照组基因表型为CC野生型。3、PTPN22-1123G＞C SNP与RA患者类风湿因子（RF）的产生有关,PTPN22-1123G＞C SNP基因分型与RF因子阳性RA患者相关P=0.041＜0.05,而与RF因子阴性RA患者无关P=0.862＞0.05。4、比较三组不同基因型RA患者的临床特征,无统计学差异,P值均＞0.05。5、实时荧光定量PCR检测结果显示,突变病人组（包括突变杂合子及突变纯合子型RA病人）PTPN22mRNA表达量是对照组（野生型健康对照组人员）的3.742倍,P=0.025＜0.05,突变病人组外周血白细胞PTPN22mRNA表达量升高。结论1、PTPN22 G-1123C位点与中国广东汉族人群RA的发病具有相关性,而PTPN22 C1858T SNP位点与中国广东汉族人群RA的发病无关;提示PTPN22 G-1123C位点的基因多态性可能是类风湿关节炎发病的一个危险因素。突变杂合子GC型发病危险度是对照组GG型的2.051倍,而突变纯合子型与RA的发病无关,PTPN22 G-1123C SNP存在杂种优势现象。2、PTPN22 G-1123C SNP与RA患者RF因子的产生有关,与RA患者的发病起始年龄、X线检查是否存在骨关节损伤无关;三组不同基因型RA患者的临床特征,无统计学差异,可能与本次研究中收集的样本量较少有关。3、突变病人组PTPN22mRNA表达量高于野生型健康对照组,可能是由于启动子区域G-1123C位点基因突变后影响了LYP蛋白的转录表达,机体为代偿这一功能缺陷而作出的保护性反应。PTPN22 G-1123C SNP致病机制可能是通过-1123C影响与转录因子激活蛋白4（AP-4）的中心基序区域（-1130gcaaGCTGaa-1121）的结合,使得PTPN22基因mRNA的转录激活受阻,LYP蛋白合成减少,最终影响T细胞信号中已磷酸化的重要酪氨酸激酶Src家族脱磷酸化,破坏了Lyp协同Csk抑制T细胞信号转导的功能,T细胞活性上调,免疫平衡遭到破坏,显著增加RA患者的发病危险性。4、本次实验为研究RA患者的发病机制提供了新的思路,并且为进一步研究PTPN22 G-1123C SNP影响LYP表达量的确切作用机制提供了理论依据。