论文部分内容阅读
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种缓慢而复杂的进行性病变过程。AS早期发病机制的研究对AS早期预防与治疗具有十分重要的意义。动脉内膜局部损伤后,血浆脂质进入动脉内膜,在内膜下间隙沉积;低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)经化学修饰成氧化型LDL(oxidized LDL,ox-LDL)或被乙酰化成乙酰LDL,修饰后的LDL经CD36、SR-A等清道夫受体,无限制地被巨噬细胞摄取而形成泡沫细胞。随着巨噬细胞内的脂质逐渐的增多和泡沫细胞不断堆积,动脉内膜下局部细胞脂代谢及炎症状态发生改变,经过一系列复杂的细胞和分子间相互作用逐渐形成动脉壁脂质条纹,即AS早期病变。巨噬泡沫细胞的形成是AS早期病变的主要事件之一。NADPH氧化酶来源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在巨噬细胞泡沫化过程中发挥着重要作用,但NADPH氧化酶在AS发生发展中的作用尚存在争议。体内实验研究表明,p47phox-/-/apoE-/-小鼠相比于apoE-/-小鼠AS病变显著降低,而且,相比于野生型小鼠,p47phox-/-小鼠动脉O2-水平显著降低。单核/巨噬细胞NADPH氧化酶来源的超氧阴离子一定程度上促进了AS的发展。另有报道显示,gp91phox-/-/apoE-/-小鼠与apoE-/-小鼠相比,AS病变无明显差异,这表明gp91phox基因缺失并不影响AS病变发展。另有研究结果表明,p47phox-/-/apoE-/-小鼠与apoE-/-小鼠相比,AS病变及实验动物的血压无明显差异,这表明,NADPH氧化酶功能的丧失并不影响apoE-/-小鼠AS病变发展。以上两种研究结果截然相反,因此,NADPH氧化酶在AS发生发展中的具体作用还需要进一步深入研究。体外实验研究表明,ox-LDL可通过Toll受体4介导的信号通路激活巨噬细胞Nox2从而产生ROS,进而促进AS的发生与发展。体外条件下,巨噬细胞泡沫化过程中产生的ROS可调节基质金属蛋白酶的活性;ROS可调节人单核细胞系THP-1 I型清道夫受体的表达;氧化应激可通过调节PPARs等核转录因子及ABCA1的表达影响人单核细胞系THP-1胆固醇外流。一系列研究说明,氧化应激可以通过调节重要核转录因子及胆固醇内流和外流相关受体来影响巨噬细胞泡沫化进程,并最终影响AS的发生与发展。但NADPH氧化酶来源的ROS在巨噬细胞泡沫化过程中的作用机制尚不十分明确。因此,本实验以体外培养的apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,利用NADPH氧化酶活性抑制剂二亚苯基碘(diphenyleneiodonium chloride,DPI)处理ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞,通过病理形态学、real-time RT-PCR和免疫细胞化学等研究手段在细胞水平和分子水平上检测各组巨噬细胞泡沫化过程中不同阶段的各项指标,旨在初步研究NADPH氧化酶对apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程的影响,以期进一步探讨巨噬泡沫细胞形成及AS发生发展的可能机制。本实验结果显示:1.细胞形态检测结果:apoE-/-和WT小鼠中,ox-LDL可在24 h内诱导小鼠腹腔巨噬细胞发生泡沫化,且随着时间的延长泡沫化程度逐渐加重。apoE-/-小鼠中,48 h内,NADPH氧化酶的活化对小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化进程无明显影响。WT小鼠中,NADPH氧化酶的活化可明显加速或促进小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化。2.活性氧检测结果:在apoE-/-和WT小鼠中,NADPH氧化酶活性可明显被DPI抑制,且DPI可明显减少ox-LDL诱导小鼠腹腔巨噬细胞超氧阴离子(O2-)和总ROS的产生(p < 0.05)。48h内,两种基因型相比,O2-和总ROS的变化无明显差异(p > 0.05)。3. NADPH氧化酶对apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化相关基因表达的影响在WT小鼠腹腔巨噬细胞中,与ox-LDL处理组相比,6 h时,DPI可显著下调Nox2、PPARα、LXRα、CD36和SR-A的mRNA水平(p < 0.05),显著上调PPARγ、NF-κB和SR-BI的mRNA水平(p < 0.05),ABCA1、p47phox mRNA水平无显著变化(p > 0.05);24 h时,ox-LDL+DPI处理组与ox-LDL处理组相比,p47phox、PPARα、PPARγ、LXRα、NF-κB、CD36、SR-A、ABCA1和SR-BI mRNA水平均被显著上调(p < 0.05),Nox2 mRNA水平无显著变化(p > 0.05)。在apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞中,与ox-LDL处理组相比,6 h时, DPI可显著上调Nox2、p47phox、PPARα、PPARγ、LXRα、NF-κB、CD36、SR-A、ABCA1和SR-BI的mRNA水平(p < 0.05)。24 h时,ox-LDL+DPI处理组与ox-LDL处理组相比,PPARα、ABCA1和SR-BI的mRNA水平被显著上调(p < 0.05),Nox2、PPARγ的mRNA水平被显著下调,p47phox、LXRα、NF-κB、CD36和SR-A的mRNA水平无显著差异(p > 0.05)。在apoE-/-和WT小鼠腹腔巨噬细胞中,24 h时,ox-LDL可通过ROS激活NF-κB,且DPI可显著抑制NF-κB的活性(p < 0.05)。24 h时,ABCA1和PPARγ蛋白表达无明显差异(p > 0.05)。综上所述,NADPH氧化酶可在一定程度上加速或促进小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化进程,可能促进AS早期病变的发生与发展。在此过程中,O2-等活性氧参与调节巨噬细胞泡沫化相关基因mRNA和蛋白水平,并可通过调节NF-κB和PPAR等关键因子来影响巨噬细胞的相应功能。