β2肾上腺素受体激动剂克仑特罗对新生大鼠心肌细胞的作用研究 β肾上腺素受体(β-adrenergicreceptorβ-AR)，是典型的G蛋白偶联受体，至少有3种亚型：β1-、β2-、β3-AR。肾上腺素受体介导的儿茶酚胺效应，在心血管功能调节中起着重要的作用。传统认为，只有β1-AR才调节心脏功能。β1-AR与兴奋型Gs蛋白偶联，激活腺苷酸环化酶，促进胞内环磷酸腺苷(cAMP)蓄积，从而引起正性变力效应，正性变时效应和正性变性效应。近来发现，β1-和β2-AR共同调节心脏的功能。但近十年的研究表明，β1-AR仅与Gs偶联，而β2-AR同时与Gs和Gi蛋白双偶联。无论生理还是病理状况下，β2-AR/Gi偶联都抑制了由β2-AR/Gs介导的正性肌力作用和正性舒张作用。因此，β1-和β2-AR在介导心脏功能方面存在差异。研究还发现，由于新生大鼠心肌细胞缺乏或很少有β2-AR/Gi偶联，β2-AR介导的新生大鼠心脏的生物效应与成年大鼠也有所不同。由于种属、细胞、以及动物年龄等的差异，目前关于β2-AR对心肌细胞作用的报道也结论不一。本学位论文就β2-AR激动剂克仑特罗(clenbuterol)在新生大鼠心肌细胞介导的生物效应进行了研究，由三部分组成：(1)β2-AR激动剂克仑特罗对新生大鼠心肌细胞受磷蛋白磷酸化的作用；(2)β2-AR激动剂克仑特罗对心肌细胞MAPK信号通路的作用及机制研究；(3)β2-AR激动剂克仑特罗对心肌细胞—氧化氮合成的作用。 第一部分 克仑特罗对新生大鼠心肌细胞受磷蛋白磷酸化的作用 背景：心肌β-AR被儿茶酚胺激活后可以增加心肌收缩并加快心肌舒张。在成年大鼠心肌细胞β2AR激活后可通过cAMP-PKA信号途径促L型钙通道开放，但对受磷蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化没有影响。推测在新生大鼠心肌细胞β2AR对PLB的磷酸化作用有可能不同于成年大鼠心肌细胞。 方法：测定给予克仑特罗后心肌细胞搏动频率和胞内cAMP水平变化的时间曲线。采用Westernblo方法，检测受磷蛋白在Serine16(Ser16)和Threonine17(Thr17)的磷酸化水平。 结果：克仑特罗以时间依赖性方式增加新生大鼠心肌细胞搏动频率以及细胞内cAMP水平。克仑特罗还可以时间-剂量依赖性的方式促进受磷蛋白在Ser16位点的磷酸化，该作用可被选择性β2AR阻断剂ICI118551和PKA抑制剂Rp-cAMP所阻断。Gi蛋白抑制剂PTX具有协同作用，但不显著。Clenbuterol还可促进受磷蛋白在Thr17位点的磷酸化，并呈时间依赖性。 结论：在新生大鼠心肌细胞β2克仑特罗可促进受磷蛋白在Ser16和Thr17位点的磷酸化，可能参与改善心脏舒张功能。 第二部分 克仑特罗对新生大鼠心肌细胞MAPK信号通路的作用及机制研究 §1克仑特罗对新生大鼠心肌细胞ERK1/2的作用及机制研究 背景：G蛋白偶联受体可通过Gi蛋白激活胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)。在不同细胞胞内cAMP积聚可增加或减少ERK1/2的活性。钙动员也参与ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的调节。在成年大鼠心肌细胞β2AR可通过Gi蛋白信号途径磷酸化ERK1/2。而β2AR可促进新生大鼠心肌细胞钙动员和cAMP水平增加但对成年大鼠心肌细胞无作用。故推测β2AR在新生大鼠心肌细胞对ERK1/2磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌细胞。本实验拟观察β2AR对新生大鼠心肌细胞ERK1/2的磷酸化作用并阐明其机制。 方法：采用Westernblot方法，检测经与β2AR信号通路有关的试剂处理的培养新生大鼠心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白和ERK2总蛋白表达水平。 结果：Clenbuterol对新生大鼠心肌细胞的ERK1/2磷酸化具有双相作用，表现为给药后磷酸化水平迅速升高，2min达到最高值，既而下降，在给药后30min降至基础水平的60％。Clenbuterol对ERK1/2的磷酸化和去磷酸化的作用均呈剂量依赖性。细胞外钙有无对clenbuterol的促磷酸化作用无影响，但兰诺丁受体(ryanodinereceptor)激动剂ryanodine对此具有协同作用。而选择性β2AR激动剂ICI118551，百日咳毒素(pertussistoxin，PTX)，钙螯合剂BAPTA-AM和兰诺丁受体阻断剂retheniumred可显著抑制clenbuterol的促磷酸化作用，而钙拮抗药硝苯地平nifedepine的抑制作用不明显。相反，蛋白磷酸酶抑制剂okadaicacid和钙泵ATP酶抑制剂thapsigargin均可翻转clenbuterol的去磷酸化作用。蛋白激酶A抑制剂Rp-cAMP也可抑制clenbuterol的去磷酸化作用。Caffeine亦对ERK1/2具有磷酸化和去磷酸化的双相作用，thapsigargin可阻断caffeine的去磷酸化作用，而okadaicacid对之无影响。Caffeine和clenbuterol一样可持续激活PLB。 结论：β2受体激活后对新生大鼠心肌细胞ERK1/2磷酸化具有双相作用，其中胞内钙动员扮演重要角色。Clenbuterol激活ERK1/2与Gi蛋白信号途径和钙库释放Ca2+有关，而clenbuterol对ERK1/2的去磷酸化作用则可能与受磷蛋白磷酸化后加快钙库摄取Ca2+有关。 §2克仑特罗对新生大鼠心肌细胞p38MAPK的作用及机制研究 背景：文献报道p38MAPK可诱导新生大鼠心肌细胞凋亡，而在成年大鼠心肌细胞βAR/Gi通路激活的p38MAPK对βAR/Gs信号通路诱导的细胞凋亡具有保护作用。本论文前部分研究表明clenbuterol通过Gs和Gi蛋白偶联对新生大鼠心肌细胞ERK1/2磷酸化具有双相作用，而在成年大鼠心肌细胞仅通过Gi蛋白偶联促进ERK1/2磷酸化。因此推测clenbuterol对新生大鼠心肌细胞p38MAPK磷酸化的作用不同于成年大鼠心肌细胞。 方法：采用Westernblot方法，检测经各种试剂处理后的培养新生大鼠心肌细胞磷酸化p38MAPK和总p38MAPK蛋白表达水平。 结果：Clenbuterol可激活p38MAPK，该作用呈时间和剂量依赖性，并能被选择性β2AR阻断剂ICI118551所抑制；Gi蛋白抑制剂PTX对clenbuterol诱导的p38MAPK磷酸化具有协同作用，而蛋白激酶A抑制剂Pp-cAMP可阻断之；钙通道阻滞药nifedipine和Ca2+螯合剂BAPTA-AM均可阻断clenbuterol对p38MAPK的促磷酸化作用。 结论：在新生大鼠心肌细胞β2AR激活后可通过Gs/cAMP信号途径促进p38MAPK磷酸化，该作用和细胞外钙内流增加细胞内钙浓度有关。 第三部分 克仑特罗对新生大鼠心肌细胞一氧化氮合成的作用 背景：一氧化氮(NitricOxide，NO)是调节心血管、免疫和神经系统功能的重要信号分子。NO具有舒张血管，对各种细胞的细胞毒性和细胞保护作用等多种生物学效应。血管平滑肌细胞、心肌细胞在受到内毒素和某些细胞因子刺激后诱生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表达增加并释放大量NO。研究表明，在患有扩张型心肌病、缺血性心肌病和其他心血管疾病的患者发生心力衰竭时，iNOS基因表达通常会增加。 在新生大鼠心肌细胞，cAMP可增加细胞因子介导的NO合成。喂食β2AR激动剂clenbuterol可诱导大鼠血管平滑肌细胞合成NO。而本论文第一部分研究表明，clenbuterol可显著增加新生大鼠心肌细胞胞内cAMP水平。在本实验中，拟观察clenbuterol对培养的新生大鼠心肌细胞的NO合成的影响。 方法：采用Griess试剂检测新生大鼠心肌细胞培养液中NO的稳定代谢产物亚硝酸盐nitrite的含量，间接反映NO含量。采用Westernblot方法，检测培养新生大鼠心肌细胞iNOS蛋白表达水平。 结果：单独给予clenbuterol对于NO合成无任何影响，但能使IL-1β诱导心肌细胞产生的NO显著增加，此协同作用呈时间-剂量依赖性。同时，clenbuterol还对IL-1β促进iNOS蛋白表达具有协同作用。非选择性β-AR阻断剂普萘洛尔propranolol和选择性β2AR阻断剂ICI118551均可阻断clenbuterol对IL-1β诱导的NO合成以及iNOS蛋白表达的协同作用。 结论：在新生大鼠心肌细胞β2AR激活可显著增加IL-1β诱导的iNOS表达和NO合成。