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目的:左卡尼汀（L-carnitine,LC）又称左旋肉碱,是人体必需的一种类维生素营养素,在动物性食品中含量丰富。临床研究发现,肝病病人体内LC缺乏,外源性补充LC对多种肝病具有辅助治疗作用。实验研究也证实,LC对多种因素诱导的肝损伤具有保护作用。目前,LC保肝作用分子机制尚未阐明,本课题将建立过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导的人HL7702肝细胞损伤模型,从抗氧化、细胞信号转导分子（Nrf2、MAPK、PI3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β）的角度探究LC保护肝细胞损伤的分子机制。方法:1.LC对H2O2损伤HL7702肝细胞活性及抗氧化能力的影响:实验设计为:正常对照组、H2O2损伤组、LC组（0.1、0.5、1.0 mmol/L）。分别以MTT、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）法检测细胞活性;酶化学法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）活性及丙二醛（MDA）含量;以2,7-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）为荧光探针,流式细胞术测定细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。2.LC对核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）/血红素加氧酶1（heme oxygenase,HO-1）通路的调控:Western blot技术检测Nrf2、HO-1蛋白的经时表达;免疫荧光染色法确定Nrf2的核转位;凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）评价Nrf2-DNA结合活性;Nrf2 si RNA技术分析Nrf2与HO-1的级联关系及Nrf2在LC保护肝细胞损伤中的作用。3.LC对丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）通路的调控:Western blot测定H2O2损伤HL7702细胞MAPK、PI3K/Akt通路的变化及LC的影响;应用相应抑制剂,分析JNK、ERK、p38MAPK在H2O2损伤HL7702细胞中的作用;采用Akt抑制剂IV评价Akt是否参与了LC的保护作用以及LC对Nrf2/HO-1通路的激活作用。4.LC对H2O2损伤HL7702细胞脂肪酸代谢、能量代谢相关基因表达的影响:Western blot技术检测过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptors-α,PPAR-α）的经时表达,并从m RNA和蛋白水平测定LC对PPAR-α及其下游基因肉毒碱棕榈酸转移酶1（CPT1）、脂肪酰基辅酶A氧化酶（ACOX）的影响;分析PPAR-α在LC保护细胞损伤中的作用及与SOD、CAT的相关性;测定H2O2损伤HL7702细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的经时变化特点及LC的调节作用;应用相应抑制剂分析AMPK在LC保护细胞损伤中的作用以及PI3K/Akt、AMPK与GSK-3β的级联关系。结果:1.以0.3 mmol/L H2O2损伤HL7702细胞12 h为病理模型。0.1?1.0 mmol/L LC剂量依赖性抑制了H2O2引起的细胞活性降低及LDH释放（P<0.05,P<0.01）。与正常对照组相比,H2O2损伤组细胞SOD和CAT蛋白表达水平显著下降（P<0.01）,SOD和CAT活性分别下降了30.07%和38.26%,ROS及MDA水平显著增加,分别为对照组的3.8倍和1.7倍;LC能够抑制H2O2引起的SOD、CAT蛋白表达及活性的降低,以及ROS、MDA水平的增加（P<0.05,P<0.01）。2.经时表达分析发现,H2O2损伤1 h细胞核Nrf2表达迅速升高,随后逐渐降低,HO-1表达呈逐渐上升趋势;LC预孵育对H2O2诱导的Nrf2核转位、Nrf2-DNA结合活性升高及HO-1蛋白表达增加均有明显促进作用（P<0.05）;Nrf2 si RNA技术将细胞Nrf2沉默后,抑制了LC的保护作用及增强HO-1表达的作用。3.H2O2损伤后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表达均迅速升高,p-Akt表达呈先升高后降低的双相改变;LC能有效抑制H2O2引起的p-JNK、p-p38MAPK表达升高（P<0.05,P<0.01）,但对p-ERK表达无明显影响;LC既能增强损伤1 h时p-Akt的升高（P<0.01）,又能抑制损伤12 h时p-Akt的降低（P<0.01）。除ERK抑制剂外,JNK、p38MAPK、Akt抑制剂均能有效抑制H2O2引起细胞活性降低（P<0.05）,且Akt抑制剂也抑制了LC对Nrf2/HO-1通路的激活作用。4.本研究首次发现,H2O2损伤肝细胞时PPAR-α蛋白表达逐渐降低;LC预孵育能增强PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表达（P<0.05,P<0.01）;PPAR-α激动剂能有效抑制H2O2引起的SOD、CAT活性及细胞活性的降低;PPAR-α抑制剂阻断了LC增强SOD、CAT表达及细胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表达在H2O2损伤后逐渐降低,LC对其均有明显抑制作用（P<0.01）,且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）及下游底物乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-Co A carboxylase,ACC）的活性降低（P<0.05,P<0.01）。AMPK抑制剂阻断了LC增强细胞活性及p-GSK-3β表达的作用,Akt抑制剂对LC增强p-GSK-3β表达的作用无影响。结论:1.LC保护H2O2损伤HL7702细胞的作用与升高SOD、CAT活性,降低ROS及MDA水平有关。2.LC通过激活Akt/Nrf2/HO-1通路保护H2O2诱导的HL7702细胞损伤。3.JNK、p38MAPK的激活参与H2O2损伤HL7702细胞,LC的保护作用与抑制JNK、p38MAPK的激活有关;ERK未参与H2O2的损伤作用,且与LC的保护作用无关。4.PPAR-α参与了H2O2诱导的HL7702细胞损伤。LC通过增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表达,激活LKB1/AMPK/ACC通路,抑制GSK-3β活性而保护H2O2诱导的HL7702细胞损伤,且PPAR-α表达增加与SOD、CAT的表达增加有关。