胶质瘤占颅内肿瘤的30-40%,具有高增殖、易复发及化疗耐药等特点。其中胶质母细胞瘤约占成人胶质瘤发生率的一半,且恶性胶质瘤约占中枢神经系统恶性肿瘤的80%。对于恶性胶质瘤的治疗目前主要采取手术切除加放、化疗的综合治疗,但病人预后依然不良,肿瘤复发快,中位生存期短,仍需要新的方法来控制其进展。结合临床,从分子生物学角度寻找能够调控多种基因从而抑制胶质瘤生物学活性的靶向基因,成为目前针对胶质瘤基础研究的热点,而核因子E2相关因子2 (nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)则具有成为靶向基因的潜质。Nrf2是近年来新发现的一种核转录因子,以其为核心的Keap1-Nrf2-ARE (antioxidant response element)信号通路作为一种新型抗氧化信号通路,可调控细胞内抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶,对正常细胞起到重要保护作用。Nrf2的表达激活可有效上调其下游多种ARE相关基因的表达,具有抗氧化应激、调节炎症损伤、缓解钙离子超载以及拮抗细胞凋亡等多重功能。但是研究表明Nrf2在多种肿瘤细胞中也有保护功能,体现了其作用的双面性。本实验室前期研究也发现Nrf2在胶质瘤细胞系U251也具有促进肿瘤细胞侵袭与迁移,并抑制细胞凋亡与自噬的作用。在此基础上,本研究提出假设：Nrf2在胶质母细胞瘤的细胞增殖、肿瘤生长与血管生成预后中起重要调节作用,并与临床预后具有关联性。对此,本研究针对胶质母细胞瘤的细胞增殖与血管生成这两种相互影响的肿瘤生物学特性,从体外细胞研究拓展到裸鼠移植瘤模型的体内研究,结合临床病例预后分析,探讨Nrf2对胶质母细胞瘤的细胞增殖、肿瘤生长及血管生成的作用及机制。本研究首先从临床病例预后分析开始。选取并收集幕上胶质母细胞瘤病人手术标本及正常脑组织,使用免疫组织化学法检测Nrf2、缺氧诱导因子1-α (Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)及血管内皮细胞标记物CD31蛋白表达水平并随访、统计病人临床病例特征及生存期,对目标蛋白之间的表达相关性及其与临床预后的关系进行统计分析。随后针对Nrt2构建下调表达质粒,通过慢病毒作为载体对胶质瘤细胞系进行转染,筛选稳定转染细胞株,使用实时PCR、Western-blot及免疫荧光法检测转染后Nrf2及其下游基因的表达改变,再检测转染后细胞的增殖活性。紧接着构建体外1%02缺氧培养模型及COC12化学诱导缺氧模型,测定缺氧环境下Nrf2表达受抑对血管生成相关因子HEF-1α与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的影响,包括细胞内HIF-1α的mRNA与蛋白水平、细胞培养上清中的VEGF蛋白含量检测等。使用人脐静脉血管内皮细胞进行小管形成实验,检测缺氧培养细胞上清液的小管形成能力。同时进行裸鼠皮下移植瘤种植实验,监测移植瘤生长变化并取瘤组织进行免疫组化染色,检测移植瘤细胞中的Nrf2、Ki67、Caspase-3及CD31表达水平并评估瘤体内微血管密度(Microvessel density, MVD)o本研究共收集68例胶质母细胞瘤组织标本与10例正常脑组织标本,免疫组化结果显示肿瘤组织内Nrf2与HIF-1α均出现表达异常增高,且两者间表达水平高低存在显著相关性(r=0.294,P=0.015); MVD值在不同的Nrf2表达水平存在显著差异,即Nrf2高表达者MVD值较高(P=0.002)；Nrf2表达高低与病人术后总生存期(overall survival, OS)长短相关,即Nrf2高表达者术后OS较短,而Nrf2低表达者术后OS较长(log-rank检验,P=0.006)。下调质粒稳定转染后,胶质瘤细胞内的Nrf2表达水平出现明显下降,其下游基因HO-1与NQO1也随之改变,而空质粒转染后较对照组未见变化,且胶质瘤细胞增殖较慢,移植瘤生长明显减慢,瘤块重量显著下降,Ki67与CD31表达较低,Caspase-3表达增加。在肿瘤缺氧模型中,稳定转染下调质粒的细胞分泌VEGF量较多,小管形成显著减少,移植瘤组织中MVD值明显下降。进一步检测显示缺氧状态下抑制Nrf2表达时,细胞中HIF-1α蛋白降解显著增加,使其在缺氧时的累积量明显减少,而mRNA水平无明显变化。综上所述,在入胶质母细胞瘤中Nrf2的表达可调控瘤体内的血管生成,而这种调控主要通过调节HIF-1α-VEGF通路来实现。结合前期实验结果,本研究显示Nrf2在胶质瘤细胞中起到重要的促肿瘤生长与血管生成的作用,为后期针对Nrf2的基因靶向治疗的深入研究铺垫了基础,也为胶质瘤的综合治疗提供了新的思路。