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纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和p一葡萄糖苷酶,上述三种酶通过协同作用将纤维素转化成葡萄糖。木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在,外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶,在木质纤维素降解成还原糖的过程中,外切葡聚糖酶起着非常关键的作用。因此外切葡聚糖酶基因的克隆表达,对于研究纤维素酶的降解机制有着十分重要的意义。本实验从四川农业大学老板山腐木中采集土样,筛选到一株高产外切葡聚糖酶的黑曲霉Asp-524,克隆其葡聚糖外切酶基因序列后,构建了诱导型表达载体,并实现了该基因在毕赤酵母的中的表达。1.本实验从四川农业大学老板山腐木中采集土样,筛选到高产外切葡聚糖酶的4株真菌。其中菌株Asp-524外切葡聚糖酶活力最高,为5.1U/mL。因此选取Asp-524为研究对象。对其进行形态观察：菌落初为白色,后变成鲜黄色直至黑色厚绒状；背面无色或中央略带黄褐色；菌丝发达多分枝,有隔多核；分生孢子头褐黑色放射状,分生孢子梗长短不一；顶囊球形,双层小梗。以Asp-524基因组为模板通过PCR扩增得到长度为599bp的ITS序列,利用MEGA4.0软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树,分析证明Asp-524同黑曲霉的ITS同源性达99%,因此鉴定Asp-524为黑曲霉(Aspergillus Niger)。2.以Asp-524为出发菌株,根据GenBank中公布的Aspergillus Niger An01c0340基因组序列,分别以Asp-524 DNA和总RNA为模板,用PCR和RT-PCR的方法扩增得到了大小均为1611bp的编码外切葡聚糖酶的基因组序列(gDNA)和cDNA序列(GenBank Accession No.HQ604862),并命名为cbhB。通过比对cbhB基因组序列(gDNA)和cDNA序列,结合GenBank数据库分析证明该基因不含内含子。3.构建诱导型表达载体。本实验设计了融合表达引物和非融合表达引物。去掉基因本身信号肽序列,在上下游两端分别引入酶切位点(上游XbaⅠ酶切位点,下游SacⅡ酶切位点),双酶切后连接到诱导型表达载体pPICZa-A上,得到融合表达载体S-pPICZaA-cbhB和非融合表达载体N-pPICZaA-cbhB。4.将重组质粒pPICZaA-cbhB转化大肠杆菌DH5α,获得阳性转化子,提取质粒,经SacⅠ线性化后,电转化酵母GS115,筛选出阳性转化子,实现cbhB基因在酵母中的分泌表达。筛选得到的转化子都具有外切葡聚糖酶活性。其中G-S-7(融合表达)和G-N一10(非融合表达)菌株表达效率最高,用1%甲醇诱导5天后,酶活分别达到了3.29U／mL和3.14UmL。