肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一种常见的功能性胃肠病。依据罗马III诊断标准,它以慢性腹部不适或腹痛、腹胀以及肠道功能的变化为特征。研究表明IBS全球的发病率为5%-15%,女性的发病率是男性的两倍,临床上以腹泻型肠易激综合征(Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)较为多见。虽然IBS-D不会导致像肠癌一样的严重疾病,但是多数罹患人群必须通过应激的管理、饮食的控制等等来避免腹泻、腹痛的发生,使得生活质量严重下降,失业率严重上升,增加了巨额医疗花费。目前该病病因和发病机制尚未明确,成为有待解决的问题。大量研究认为遗传因素可能参与IBS的发病,尤其影响了50%的女性IBS人群。英国遗传研究发现,5-HT3受体亚型5-HT3A受体变异型基因c.-42C>T (rs1062613)和5-HT3E受体变异型基因c.*76G>A(rs56109847)可能与IBS的易感性有关,但在德国人群中没有得到证实,可能与种族和遗传特性不同有关。但迄今为止,还未有研究关注在中国黄种人群中,这两种受体变异性基因与IBS及其亚型是否存在关联。新近研究发现一类调控小分子MicroRNAs (miRNAs),它是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA, miRNA主要通过与靶mRNA的3端非翻译区(3’UTR)碱基互补,特异性序列结合,对基因进行转录后水平的调控。研究发现miRNA靶基因的3’UTR结合区域的单核苷酸多态性位点(SNP)可以影响miRNA与靶区域的结合效率,使miRNA调控作用发生改变,进而改变靶基因或靶蛋白表达水平或方式,最终影响疾病的发生。本研究首先采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)对IBS-D患者与健康对照者5-HT3A基因5’端非翻译区(5’UTR) c.-42C>T (rs1062613)和5-HT3E基因3’UTR c.*76G>A (rs56109847)进行研究。探讨这两种SNP与IBS-D的发生及症状的关联。其次通过生物信息学预测及文献资料,查找与5-HT3E基因3’UTR中的SNPrs56109847有潜在结合能力的miRNA,通过双荧光素酶报告基因实验对5-HT3E 3’UTR SNP rs56109847进行功能研究。再次,通过5-HT3E不同基因型IBS-D患者结肠粘膜5一HT3E表达的分析了解SNP对肠道5-HT3E表达的影响。最后探讨了IBS-D重叠PMS患者中医证型及妇科经历、肠道症状和心理症状的特点。研究内容分为5部分：1.5-HT3A、5-HT3E基因非翻译区多态性与中国扬州地区汉族人群IBS-D的关联研究目的：探讨扬州地区门诊IBS-D与5-HT3R的亚型5-HT3A、5-HT3E基因非翻译区多态性的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)对450例IBS-D患者与300例健康对照者5-HT3A基因5’UTR c.-42C>T (rs1062613)和5-HT3E基因3’UTR c. *76G>A (rs56109847)进行研究。结果：男女性患者5-HT3A c.-42C>T多态性位点基因型分布较正常对照的差异有统计学意义,且T等位基因的频率与正常对照比较均有显著增高；女性患者5-HT3E c.*76G>A多态性位点GA基因型和A等位基因的频率较正常对照均显著升高,男性两组间的差异无统计学意义；与5-HT3A基因的rS1062613位点CC基因型及5-HT3E基因的rs56109847位点GG基因型相比,TT基因型及GA基因型与女性IBS-D密切相关。结论：5-HT3A基因rs1062613位点T等位基因和5-HT3E基因rs56109847位点的GA基因型分别是中国扬州地区汉族人群IBS-D患者和IBS-D女性患者的重要易感因素之一。2.5-HT3A、5-HT3E基因非翻译区多态性与女性IBS-D症状的关联研究目的：探讨5-HT3R的亚型5-HT3A和5-HT3E基因非翻译区多态性与非绝经期女性IBS-D患者肠道和心理症状的关联。方法：采用PCR-RFLP方法对104例非绝经期IBS-D女性患者5-HT3A基因5’UTRc.-42C>T (rs1062613)和5-HT3E基因3’UTR c.*76G>A(rs56109847)进行研究。结果：5-HT3E GA基因型患者较GG基因型腹胀频率更高,两组患者排便性状也存在很大差异；5-HT3A TT基因型患者较c等位基因携带者有更加频繁的排便急迫感和不尽感,两组患者排便性状也存在很大差异；5-HT3A CC基因型患者较T等位基因携带者存在更加严重的焦虑症状。结论：5-HT3A TT基因型和5-HT3E GA基因型可能是非绝经期女性IBS-D患者肠道症状恶化的重要因素,而5-HT3A CC基因型则与患者焦虑症状密切相关。3.MiR-510对野生型和突变型5-HT3E基因3-UTR作用的研究目的：在第一第二部分发现5-HT3E基因的GA基因型与女性IBS-D的的易感性和肠道症状严重度有关的基础上,进一步研究其机制。方法：通过生物信息学预测及文献资料,我们发现,5-HT3E基因的3’UTR SNPrs56109847位点被预测位于miRNA-510的结合识别区域,可能会影响niRNA-510与靶mRNA的结合。为了证明我们的假设,我们设计了双荧光素酶报告系统实验,通过检测荧光素酶的表达来验证SNP是否影响基因表达。首先我们构建了含有SNP的海。肾荧光素酶重组质粒(pRL-TK-5-HT3E-3’UTR-c.*76A/G),然后与荧光素酶报告载体(pGL3-control)、 miRNA-510质粒或者阴性对照‘miRNA质粒一起共转染培养细胞(HEK293和HT-29),最后运用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度,验证miR-510是否与5-HT3E野生型3’UTR重组质粒结合以及明确突变型(rs56109847G—A)是否影响miR-510与靶基因的结合。pRL-TK-5-HT3E-3’UTR-c.*76A/G与pGL3-control共转染细胞,检测未有miR-51 0参与SNP是否影响基因的表达。结果：仅转染pRL-TK-5-HT3E-3’UTR-c.*76A/G及pGL3-control时,c.*76G组相对荧光素酶表达水平与c.*76A组及空白对照组相比HEK293和HT-29两个细胞系均无显著性差异。而将c.*76G与pGL3-control及miR-510质粒共转染时相对荧光素酶表达水平与c.’76A组相比两个细胞系均显著降低。但两种重组质粒与negtive controls质粒共转染时相对荧光素酶表达水平均无显著性差异。结论：5-HT3E rs56109847位点G等位基因能够与miR-510发生特异性结合,而突变型(rs56109847G—A)可能因为靶基因3’端突变逃逸了miR-510正常的调节作用。4. IBS-D女性患者5-HT3E基因3,UTR多态性与肠粘膜5-HT3E表达的关联研究目的：探讨扬州地区IBS-D女性患者与正常对照结肠粘膜5-HT3E蛋白表达的异同以及IBS-D女性患者5-HT3E rs56109847基因多态性与结肠粘膜5-HT3E蛋白含量之间的关联。方法：采用PCR-RFLP方法对53例IBS-D女性患者5-HT3E rs56109847进行基因分型；采用免疫组化和Western blot技术对IBS-D患者和健康对照者结肠粘膜5-HT3E的表达进行检测。结果：5-HT3E大量表达于结肠粘膜腺体周围,少量表达于间质中；IBS-D患者结肠粘膜组织中5-HT3E的蛋白表达高于正常组织；GA杂合子患者结肠粘膜5-HT3E的蛋白表达高于GG纯合子。结论：5-HT3E在女性IBS-D的发生过程中可能发挥了重要的促进作用；SNP rs56109847与5-HT3E的蛋白表达相关。5. IBS-D重叠PMS患者中医证型及心身状况研究目的：探讨IBS-D重叠经前期综合征(PMS)患者中医证型及妇科经历、肠道症状、心理症状的特点。方法：参考包含罗马ⅢI标准和SCL-90量表的前期国外研究,采用问卷调查的方式对113例重叠患者和102例IBS-D患者进行研究：(a)了解重叠患者中医证型与心理症状的关联；(b)比较重叠组与IBS-D组心理症状的异同；(c)比较两组间妇科经历的异同；(d)比较两组间排便特点和排便习惯的异同。结果：重叠患者四种中医证型中,肝相关证型较非肝相关证型在焦虑、抑郁上有显著差异；绝大多数重叠患者都报告有剖宫产史、反复流产史以及PMS历史；与IBS-D组相比,重叠组中绝大多数都有严重痛经和较长的月经期；与IBS-D组相比,重叠组有更加严重的肠道症状和焦虑症状。结论：重叠症肝相关证型较非肝相关证型存在更加严重的焦虑和抑郁症状；重叠患者与单纯IBS-D患者在妇科经历、肠道症状的严重度和焦虑症状上存在显著差异。综上所述,我国扬州地区汉族人群IBS-D的发生、流行以及肠道症状的严重度可能与5-HT3A基因5’UTR c.-42C>T多态性位点T等位基因和5-HT3E基因3’UTR c.*76G>A多态性位点A等位基因所决定的遗传易感素质密切相关。其可能机制之一：5-HT3E rs56109847G—A多态通过影响miR-510对5-HT3E基因3’UTR的识别结合,减弱其对5-HT3E mRNA翻译的抑制作用,导致5-HT3E蛋白表达的增高,从而增加了IBS-D的发病风险。