研究背景梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种长期慢性性传播疾病,可侵犯人体多个器官和系统,甚至可以引起包括神经系统在内的一些实质性器官不可逆的组织损伤,导致多种并发症。其中,神经梅毒是最严重的并发症之一。近年来,梅毒发病率快速增加,每年约有110万人感染梅毒,对公共卫生构成严重威胁,引起全球关注。尤为值得注意的是,HIV/梅毒共感染近年来呈上升趋势.在性传播过程中,约25%一期、二期梅毒患者共感染HIV,梅毒感染也增加了HIV的易感性(达8倍)。因此在国家卫生部制定的[中国预防与控制梅毒规划(2010-2020年)]中,提出5年有效遏制疫情快速攀升势头,10年降低发病率,基本消除先天梅毒,并指出将控制HIV感染与阻断梅毒感染置于一个预防体系之下。梅毒合并HIV感染引起系统性免疫激活,破坏粘膜和上皮屏障,引起组织损伤,因而使得神经梅毒的发病率显著上升。深入了解梅毒合并HIV感染导致的神经梅毒在我国的流行特征,有助于进一步开展对该合并感染导致的中枢神经系统损伤的早期诊断,对于疾病预防和临床治疗具有十分重要的意义。迄今,神经梅毒诊断没有特异性和敏感性均好的金标准。目前,世界各国有关神经梅毒诊断的指南中将脑脊液中VDRL阳性为诊断神经梅毒的相对金标准。当CSF-VDRL阴性时,诊断神经梅毒主要依靠脑脊液里白细胞或总蛋白升高。然而,HIV感染自身也会引起脑脊液中白细胞的异常。因此,HIV/梅毒共感染的患者诊断神经梅毒面临更大困难。一般认为,合并HIV感染的梅毒患者,建议做脑脊液检查以排除神经梅毒。美国CDC针对腰穿的指导指南为有神经症状、眼部症状、晚期潜伏梅毒、病期不明的潜伏梅毒、治疗失败及合并HIV感染的患者建议做腰穿,但是否对所有合并HIV感染的梅毒患者均要作腰穿监测尚存争议。因此,了解和掌握HIV/梅毒共感染人群中神经梅毒发病情况及其相关的有诊断价值的临床和实验检查指标,可为早期神经梅毒的诊断提供线索,指导脑脊液的检查。据我们所知,在中国HIV/梅毒共感染的男性人群中神经梅毒发病情况及相关因素研究尚未有报道。已知,机体的免疫状态在清除病原微生物的过程中发挥重要作用,而不适当的免疫应答导致的炎症反应会引起包括中枢神经系统在内的组织损伤。梅毒螺旋体的中枢感染是否也存在同样的机制迄今不明。神经小胶质细胞是中枢神经细胞的免疫细胞,含量较少。当中枢神经系统受到外伤、感染及功能失调时,在致炎因素作用下小胶质细胞被激活,参与多种神经系统疾病的发病如阿尔茨海默病(AD)。梅毒螺旋体感染所引起的麻痹性痴呆在认知损害方面和AD非常相似。梅毒螺旋体进入中枢神经系统后,静止的小胶质细胞被活化并释放炎症介质,是否也会引起神经毒性,对神经元引起“二次损伤”,值得我们探讨。我们运用神经小胶质细胞原代培养技术来进行上述研究。神经小胶质细胞原代培养为研究小胶质细胞参与多种神经系统的发病机制打下基础,使体外实验成为可能。体外神经小胶质细胞原代培养早期由McCarthy与Gulian建立,但培养步骤较繁琐,获得的小胶质细胞量少,纯度低。后来,多种小胶质细胞的原代培养方法均在此方法上进行改进,但目前仍没建立一种标准的稳定的高效的神经小胶质细胞的原代培养方法。研究目的：第一部分.1.了解掌握在HIV/梅毒共感染的男性人群中,神经梅毒的发病情况。2.分析神经梅毒的相关因素,为神经梅毒的早期诊断提供有价值的临床和实验检查指标。第二部分.1.建立一种稳定的高效的鼠神经小胶质细胞原代培养,为后续体外实验奠定基础。2.初步探索梅毒螺旋体刺激鼠神经小胶质细胞的活化作用。研究方法：第一部分.我们收集来自2009年1月至2014年8月上海市皮肤病医院性病科的男性HIv/梅毒共感染患者共178例。在研究对象自愿签订知情同意书后,做一对一面对面调查,填调查问卷,收集社会人口学特征、行为学特征、梅毒、HIV等相关临床资料。空腹12小时采集静脉血,分别收集血浆和血清,检测血RPR和TPPA,用以诊断梅毒。做腰穿来收集脑脊液,检测CSF-VDRL、CSF-TPPA、CSF-WBC和CSF-Tpr等用来诊断神经梅毒。神经梅毒的相关因素用二分类Logistic回归多元分析模型方法进行分析。第二部分.1.我们选用新生24小时内C57BL/6J小鼠8-16只,取大脑皮质,制成单个细胞的悬液,进行混合胶质细胞培养,结合营养剥离法。等混合细胞培养出现明显分层,在3712恒温下用振摇法分离纯化小胶质细胞.分离后的小胶质细胞,在倒置显微镜下对小胶质细胞计数,用CDllb抗鼠/人抗体(PE)对小胶质细胞进行荧光染色,最后用流式细胞术检测小胶质细胞纯度。2.把分离纯化后获得的小质细胞按约1×105个/孔接种到12孔培养板。实验分3组：实验组加梅毒螺旋体1：100;阴性对照组加相同体积的培养液；阳性对照组加1μg/mLLPS,各组均设复孔。分别刺激小胶质细胞24小时后,用0.25%胰酶消化收集小胶质细胞,分别染抗CD80+荧光抗体。以Flowjo软件进行获取分析流式图。用流式细胞术测阴性对照组、阳性对照组、实验组小胶质细胞CD80表达百分比。研究结果第一部分：1.178例HIV/梅毒共感染男性患者年龄中位数为31岁(范围：18-75岁)。大多数患者为男男同性恋(56.7%)。有4例一期梅毒,96例二期梅毒,7例早期潜伏梅毒,71例晚期潜伏梅毒及病程不明的潜伏梅毒,分别占比例为2.2%、54%、3.9%和39.8%。神经梅毒的发病率在二期梅毒、早期潜伏梅毒、晚期潜伏梅毒及病程不明的潜伏梅毒所占比例分别为25.0%、14.3%和22.5%。2.有41例HIV/梅毒共感染患者符合神经梅毒诊断,占比例为23%。神经梅毒和外周血CD4+T细胞数≤350个/uL((0R,8.08：95%CI,2.12-30.78：P<0.05)具有显著相关性。年龄、梅毒分期、神经症状、眼部症状和血RPR滴度≥1：32和神经梅毒均无明显相关性。第二部分：1.我们采取营养剥离法和机械振摇法分离纯化鼠神经小胶质细胞,获得小胶质细胞量为1×106个/培养瓶(25cm2),纯度达到88%以上。2.与阴性对照组(CD80百分比0.44%)相比,实验组和阳性对照组CD80表达的百分比分别为0.79%、1.01%。可见LPS能明显激活神经梅毒小胶质细胞,使其抗原提呈作用增强,但梅毒螺旋体刺激小胶质细胞的活化作用不明显。结论：第一部分在HIV/梅毒共感染人群中,外周血CD4+T细胞数≤350个/uL是神经梅毒的一个危险因素,可以作为做腰穿的指标。单一的血RPR滴度≥1：32不能作为腰穿的临界值,还需结合其他临床和实验检查指标进行评估是否做脑脊液检查。另外,加强对性伴的性病筛查对控制梅毒播散具有重要作用。第二部分1.我们建立一种稳定的高效的鼠神经小胶质细胞原代培养,为后续研究神经梅毒发病机制的体外实验奠定基础。2.梅毒螺旋体刺激小胶质细胞活化作用不明显。尚需进一步纯化梅毒螺旋体混合液,探索梅毒螺旋体刺激小胶质细胞的活化作用。