茶多酚体外活性评价体系建立及EGCG生物修饰的研究

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茶多酚(TP)是茶叶中多酚类物质及其衍生物的总称,具有很强的抗氧化作用,其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)和2,6二叔丁基对甲酚(BHT)的4~6倍,是维生素C的5~10倍。随着研究的深入,它的应用领域在不断扩展。 目前对于茶多酚清除自由基能力的研究多采用荧光法(FR)、化学发光法(CL)、电子顺磁共振(ESR)及脉冲辐解(PR)等方法,所用仪器比较昂贵,操作复杂。茶多酚生产的方法主要有溶剂法、沉淀法、吸附法等。茶多酚分子结构中含有众多的酚羟基,这是其具有优异抗氧化作用的原因,也是其水溶性强而脂溶性差的原因。茶多酚改性的研究主要是采用化学法,也有采用酶法修饰儿茶素系列物质的报道,但是关于儿茶素及其单体在非水介质中酶促选择性酰化反应的研究却未见相关报道。 本研究以茶多酚对照品为实验对象,对目前常用的抗氧化体外活性检测方法进行了评价,通过稳定性、精密度及反应体系光谱扫描实验,最终优选和优化的适合茶多酚等植物多酚类物质体外活性评价方法为:直接反映样品的抗氧化活性采用DPPH·法,清除·OH自由基能力采用苋菜红褪色光度法,清除·O2-自由基的能力采用光照核黄素-NBT法。 采用氮气保护-超声波法提取茶多酚,利用活性评价体系比较氮气保护与无氮气保护浸提液清除·OH、·O2-自由基的能力。结果表明氮气保护浸提液清除·OH及·O2-自由基能力均大于无氮气保护浸提液。通过酒石酸铁法测定氮气保护与无氮气保护浸提液茶多酚含量依次为7.51 mg/mL、5.22 mg/mL,表明氮气可以有效抑制茶多酚的氧化。氮气保护与无氮气保护浸提液经旋转蒸发、烘箱干燥后得到绿茶粗提物质量分别是3.74 g、3.76 g,说明氮气并不影响浸提率。 采用D101大孔吸附树脂分离纯化茶多酚,D101树脂对茶多酚的静态吸附量为41.12 mg/g,静态解吸附率为96.5%,按照上样,pH3.0蒸馏水洗脱,氯仿洗脱,80%无水乙醇洗脱的顺序(上样流速1.5 mL/min,洗脱流速2.0 mL/min),最终从0.5 g粗提物中得到0.19 g含量为96%的茶多酚样品。 研究了非水介质中固定化脂肪酶Novozym435(来源于Candida antarctica)酶促EGCG选择性酰化反应,探讨了有机溶剂种类、水活度、酰基供体对酶促酰化反应的影响,通过LCQDECA液质联用仪对反应后混合物进行了初步鉴定,采用Vector33傅里叶变换红外光谱仪对EGCG修饰前后的结构进行了对比。结果表明,在叔戊醇体系中,Novozym435脂肪酶可以选择性催化EGCG与丁酸乙烯酯的反应。反应混合物经质谱鉴定发现有单一取代的修饰产物,EGCG反应前后红外图谱对照表明,酰化后EGCG主体结构与EGCG类似,其分子中引入了四碳链的烷基,但是酰化位点并不确定。
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