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壳囊孢菌素B(Cytosporone B，Csn-B)是从小穴壳菌属(Dothiorella sp.)真菌HTF3中分离得到的一种天然产物，是天然的Nur77受体激动剂，有较好的抗真菌及抗肿瘤活性。阿霉酮B(AmoitoneB，AmB)作为Csn-B系列衍生物的一种，由厦门大学化学系合成，具有更强的Nur77结合及激活特性，能够特异地结合到Nur77配体结合区域，激活其活性，介导Nur77抑制抗细胞凋亡蛋白BRE(Brain and reproductive organ-expressed protein)的转录活性，转移Nur77到线粒体中引起细胞色素C的释放来诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长，可作为一种有前途的药物用于癌症的治疗。阿霉酮B主要用于胃癌、结肠癌的治疗;对肺癌、肝癌的治疗还在研究阶段。然而，阿霉酮B极难溶于水的特性导致其口服生物利用度低;采用有机溶剂溶解制成注射剂，易导致全身过敏反应，治疗指数低。临床需要一种给药次数少、生物利用度高、稳定性好、制备简单且利于患者使用的制剂。
本课题采用纳米结晶技术(nanocrystal technology)，用高压微射流均质法(microfluidization method)将阿霉酮B制备成纳米结晶混悬液(Amoitone B nanocrystal suspensions，AmB-NSP)。本文首先考察了微射流均质过程中压力及循环次数对阿霉酮B纳米结晶的粒径及多分散指数(polydispersity index，PI)的影响;同时以Zeta电位为指标，采用正交实验法对预选的稳定剂Lecithin、PluronicF68、HPMC及PVPK30的组合及用量进行了筛选，得出AmB-NSP的最优处方和工艺参数。然后将最优工艺的AmB-NSP进行冷冻干燥，并对其冻干保护剂的种类、用量进行了筛选;测定了AmB-NSP冻干制剂的饱和溶解度及体外溶出度;采用DSC和XRD技术研究了AmB-NSP冻干制剂的晶型结构;同时对AmB-NSP冻干制剂在不同条件下的贮存稳定性进行了研究。接下来采用HPLC法对AmB-NSP静脉注射后在家兔体内的药代动力学及小鼠体内的组织分布特征进行了考察。本课题最后对AmB-NSP的体外抗肿瘤效果进行了系统考察，证实了AmB-NSP能显著提高AmB对肿瘤细胞的杀伤作用。
通过预实验及正交实验确定的AmB-NSP的最优制备工艺如下:选择Lecithin及PluronicF68作为联合稳定剂，原料药AmB与Lecithin、F68的用量比为1∶1∶1。将AmB、F68、Lecithin悬浮于50ml注射用水中，超声处理15min后，高速剪切机20000rpm预分散10min。对所得的粗混悬液经由微射流高压均质机于500bar、1000bar的压力下分别均质3次，再在1800bar下均质15次，即得AmB-NSP。透射电镜及激光衍射测定仪分析显示，制得的AmB-NSP为类球形，表面光滑圆整，分布均匀，平均粒径在256.3nm左右，多分散指数PI为0.206。AmB-NSP在4℃放置1个月，粒径没有较大改变，物理稳定性良好。
本文选用5％(w/v)的甘露醇作为冻干保护剂，将优化制得的AmB-NSP进行冷冻干燥，首先在-80℃的超低温冰箱中预冻24h，然后在真空冷冻干燥机中(-50℃、15mTorr)冻干48h，即得AmB-NSP的冻干粉针。激光衍射测定仪分析显示，AmB-NSP冻干粉针的平均粒径为275.4±7.98nm，PI为0.220±0.013，Zeta电位为-24.05±0.59mV，与冻干前相比变化不大。DSC、XRD对AmB-NSP的晶型分析结果表明，AmB在冻干品中仍以晶体形式存在，微射流及冻干过程未对其晶型结构产生影响。将AmB-NSP冻干粉于20～25℃、3～5℃条件下贮存三个月，仍为白色疏松的粉末，色泽均匀，再分散性良好，可长期贮存稳定。
本文采用恒温磁力搅拌法对AmB-NSP冻干粉的饱和溶解度进行考察，结果显示，纳米结晶使AmB在0.1％SDS-水中的溶解度由26.94±0.58μg·ml-1提高到405.53±1.73μg·ml-1;在0.05％Tween80-水中由72.11±1.23μg·ml-1提高到388.20±2.07μg·ml-1。采用小杯桨法对AmB-NSP冻干粉在0.05％Tween80-水中的体外溶出度进行考察，在5min时，AmB-NSP冻干粉中药物的溶出度为53.33％，而原料药仅为6.06％，提高了近9倍;120min时，AmB-NSP冻干粉中药物溶出已达95.0％，而原料药只溶出43.0％。可知AmB-NSP由于减小的粒径及增大的表面积导致AmB的溶解度及溶出速率大大提高。AmB-NSP的体外释药符合Biexponential方程:1-Q％=0.4845e-0.6036t+0.4483e-0.0324t,r=0.9991.
以AmB-Sol为对照，系统研究了阿霉酮B纳米结晶经家兔耳缘静脉注射后体内的药动学情况。AmB-Sol静注后家兔体内的药动学方程为:C=4.422e-13.169t+1.416e-1.591t+0.453e-0.231t，Cmax=3.262μg·ml-1，分布、消除半衰期及平均滞留时间MRT均很短，分别为t1/2β=0.436h，t1/2γ=2.999h，MRT=2.257h，清除率CL=2.327L·h-l·kg-1，AUC(0-∞)为3.439h·μg.ml-1，而静脉注射AmB-NSP后，家兔体内药物动力学有明显改变，其药动学方程为:C=12.341e-14.699t+1.12e-1.035t+0.212e-0.082t，Cmax=5.202μg·ml-1,t1/2β0.67h,t1/2γ=8.446h,MRT=3.703h,CL=1.632L·h-1·kg-1,可见消除半衰期及平均滞留时间MRT明显延长，清除率降低。AUC(0-∞)则增大至4.902h·μg·ml-1。
小鼠体内组织分布试验结果表明，AmB-Sol和AmB-NSP静脉注射后药物在各组织中的分布显著不同。静脉给予AmB-NSP后相对摄取率re从高到低依次为肝3.32、肺2.50、血2.07、脾1.42、肾0.82、心0.77，显示出明显的肝、肺靶向性;同时，AmB-NSP相对于溶液剂在血浆及各组织的峰浓度比Ce为血1.78、心0.44、肝3.87、脾2.30、肺4.30、肾0.40，可见纳米结晶使AmB在肝、肺及血浆中的分布大大提高，显著降低了其在心、肾的分布，在一定程度上减少了心、肾毒性。
本文采用MTT试验、细胞荧光染色、流式周期及凋亡检测试验对AmB-NSP的体外抗肿瘤活性及凋亡机制进行了考察。MTT实验显示，AmB-Sol培养BGC-823、SW620、HepG2、H460细胞72h的IC50值分别为:10.38μg/ml、10.63μg/ml、13.58μg/ml、13.90μg/ml;AmB-NSP培养上述四种细胞对应的IC50值分别为6.76μg/ml、6.93μg/ml、10.03μg/ml、9.74μg/ml。结果表明，AmB对BGC-823和SW620细胞的杀伤效果较强，而对HepG2和H460细胞的抑制作用相对适中，抗肿瘤活性具有细胞选择性;AmB-NSP较AmB-Sol对肿瘤细胞的杀伤作用显著增强，并具有时间和剂量依赖性。这可能是因为纳米结晶显著提高了AmB的溶解度和溶出速率，使其在肿瘤细胞表面达到足够的药物浓度;再者，纳米结晶促进了AmB对肿瘤细胞膜的粘附性和渗透性，增大了肿瘤细胞对AmB的内吞作用，从而提高了抗肿瘤效果。此外，PI染色和Hoechst染色也进一步证实了AmB-NSP能促进肿瘤细胞的凋亡，具有更强的癌细胞毒性。
流式细胞仪周期检测结果显示，AmB能将BGC-823细胞捕获在G1期，AmB-NSP显著增大了细胞在G1期的比率。由此推测，AmB-NSP诱导细胞凋亡可能发生在G1期。凋亡检测定量地反映了AmB诱导细胞凋亡不同时期的比率，证实了纳米结晶能促进AmB对癌细胞的凋亡作用并具有剂量依赖性，在抗肿瘤治疗方面有潜在的应用价值。
本文将难溶性抗癌药阿霉酮B开发为纳米结晶在国内外是首次报道，为其深入研究和开发为注射剂应用于临床提供思路和参考依据，具有较高学术价值。