研究背景与目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease.AD)作为一种多发生于老年和老年前期以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经退行性疾病,其典型神经病理学改变为神经细胞外老年斑、神经纤维缠以及皮层血管淀粉样变性等,但其致病机制一直不甚清楚。随着分子医学的飞跃发展,越来越多的实验证据支持β淀粉样蛋白级联学说这一AD病因假说。该学说认为:在AD患者中,由于基因突变以及环境因素影响,导致Aβ42的产生增多或者降解障碍,从而在大脑中发生堆积,进而活化小胶质细胞和星型胶质细胞,影响神经元的离子平衡、导致氧化损伤等使得神经元功能障碍。其中,小胶质细胞的活化是其关键步骤之一。作为单核吞噬细胞系统中的一员,小胶质细胞通过一方面通过受体介导吞噬、降解Aβ片段从而有利于Aβ斑块的减少,但与此同时把Aβ的异常沉积作为“危险物质”,启动了外源性的抗原呈递过程引发局部无菌性炎症释放炎症因子TNF-α、NO、IL-1β、IL-6、IL-12等,致使邻近神经元死亡和胶质瘢痕形成进而导致病症发生。因此找到一条有效途径能够充分发挥小胶质细胞吞噬Aβ的有益作用,而抑制小胶质细胞抗原呈递过程中的有害作用将能够极大的减轻AD的炎症病变,延缓病程。血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)是由28个氨基酸组成的神经多肽,主要由肽类神经元分泌,通过结合表达于免疫细胞上的G蛋白偶联的受体在保持神经免疫网络稳定上发挥重要作用。最近在小胶质细胞上的研究证实:VIP能够通过小胶质细胞上的受体介导的cAMP/MEKK/c-JUN途径以及非cAMP依赖的IKK/IKB途径拮抗内毒素诱导的IL-12、TNF-α和iNOS表达,从而减轻大脑炎症。而且VIP能够通过抑制Jak-STAT1途径有效抑制IFN-γ刺激活化的小胶质细胞表达CD40从而有效抑制小胶质细胞向抗原呈递细胞的转化。由此提示我们VIP在调节炎症因子介导的小胶质细胞活化中可能具有重要作用。回顾既往,早在1984年,Arai H等对AD患者进行放免测定就发现VIP在AD患者的大脑皮层中分泌减少。Zhou JN等的研究也证实在65岁以下组的女性AD患者中大脑SCN区VIP神经元存在明显的丢失。结合这一线索我们推测:在AD病程中,VIP神经元的丢失导致VIP分泌的减少,加速了小胶质细胞的活化,从而促进了AD病理的发展。因此,外源适当补充VIP,通过调节Aβ活化的小胶质细胞的状态,增强其对Aβ的吞噬清除功能、减少释放炎症因子以及与抗原呈递功能相关的共刺激分子的表达,可以改善和延缓AD病情的发生和发展,从而成为AD治疗的一种新的方法和途径。由于目前关于VIP调节Aβ42介导的小胶质细胞活化尚未见报道。为证实该推测,我们进行了了如下研究:在体外细胞实验中比较Aβ活化后的小胶质细胞在有无VIP以及不同的时相点下其吞噬Aβ功能、细胞因子谱系与抗原呈递功能相关的共刺激分子CD40等表型,验证VIP是否具有调节Aβ活化的小胶质细胞功能状态的作用;在此基础上,我们利用pAdEasy腺病毒载体系统构建、纯化了分泌型腺病毒表达载体并定位注入PS1/APP双转基因小鼠的海马区,通过转基因形式的VIP分泌,以保证VIP的在局部脑区浓度的持续稳定,而后检测了动物老年斑沉积的改变、小胶质细胞、星形胶质细胞活化等改变以及行为学变化。结果如下:一、VIP干预对Aβ42活化小胶质细胞株N9细胞吞噬、分泌功能的影响RT-PCR证实小胶质细胞细胞株N9细胞能够组成性表达VPAC1和PAC1,VPAC2在LPS刺激后表达增强,而后分别检测VIP干预对N9细胞吞噬功能、分泌功能以及免疫共刺激分子的表达的影响。得到以下结果:①吞噬功能实验表明:小胶质细胞在老化的Aβ42直接刺激后能够轻微活化吞噬Aβ42,但其效应比较微弱。而在同时加入VIP刺激小胶质细胞活化后,N9的吞噬作用明显增强,在数小时内即可达到高峰。PKC通路激活剂PMA可模拟该作用,而且该增强作用在加入PKC肽抑制剂后下调,提示VIP促进小胶质细胞吞噬作用的途径可能与PKC途径活化有关。②细胞因子分泌以及共刺激分子检测表明:小胶质细胞N9在Aβ42联合小剂量IFN-γ刺激后,上清中NO2-及TNF-α分泌增加,细胞膜CD40分子表达上调,加入VIP后,该刺激效应受到明显抑制,提示VIP能够调节Aβ42联合小剂量IFN-γ对小胶质细胞的活化效应。以上结果提示应用VIP有助于促进小胶质细胞吞噬Aβ42,减轻Aβ斑块沉积以及小胶质细胞活化后炎症因子的释放从而减轻神经毒性作用,为后续体内实验奠定了基础。二、分泌型VIP腺病毒载体的构建及其功能性表达通过RT-PCR技术从C57/BL6小鼠的大脑总RNA中扩增出了VIPmRNA的全长,进一步利用pAdEasy腺病毒系统成功构建了重组VIP腺病毒载体并在293细胞中成功进行了表达。结果如下:首先将扩增出的VIPmRNA全长亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-VIP,而后在E.coli内进行同源重组。酶切、测序证实我们构建出了腺病毒载体pAdEasy-VIP。进一步在293细胞中获得了包装、扩增,并通过RT-PCR和免疫组化分别从mRNA和蛋白质水平证明了我们所需要的VIP多肽在293细胞上成功的进行了表达,ELISA检测证实与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中VIP多肽的表达明显增高,证明我们成功构建了重组VIP腺病毒载体,为下一步进行基因转移提供了有效的分子工具。三、海马定位注射重组VIP腺病毒对PS1/APP双转基因小鼠的病理学及行为学影响①对转基因小鼠杂合体种鼠(来源于Jackson实验室)进行繁殖,剪取鼠尾提取基因组DNA,并进行基因型分析,筛选得到了不同月龄的APP/PS1双转基因AD小鼠。抗Aβ免疫荧光组织化学染色显示9个月左右PS1/APP双转基因AD小鼠的皮层及海马区有大量的Aβ染色阳性斑块,随着年龄的增长其沉积亦更加明显,在14月左右的转基因小鼠脑内证实小胶质细胞和星型胶质细胞在Aβ沉积周围已明显聚集、活化。透射电子显微镜下海马区Aβ周围神经元溃变、肿胀,神经突触稀松形态不一,微管小泡及线粒体堆积,胶质细胞包绕Aβ斑块。水迷宫实验发现该小鼠逃避潜伏期较对照鼠显著延长。表明APP/PS1双转基因AD小鼠具有AD主要的病理及行为学特征,为本研究提供了理想的AD动物模型。②选取14月转基因小鼠海马定位注射重组VIP腺病毒而后检测Aβ斑块、胶质细胞的活化可见:在体内腺病毒可以有效转染扩散并长时间表达目标蛋白。免疫组化检测表明注射病毒1、2、4周后,重组VIP腺病毒注射组相海马区Aβ斑块沉积比对照空白腺病毒组明显下降,且在腺病毒注射部位周围比较明显。对比不同时相点可见:在注射的1周Aβ斑块沉积即开始减少,第2、4周进一步下降。比较胶质细胞的活化可见重组VIP腺病毒注射组相比对照空白腺病毒组:小胶质细胞活化比例增加,而星型胶质细胞无明显变化。结合体外实验我们认为:通过定位注射重组VIP腺病毒能够有效减轻Aβ斑块沉积,其机制可能与小胶质细胞活化后吞噬功能增强相关。但是水迷宫实验逃避潜伏期对比示注射重组VIP腺病毒小鼠和对照组小鼠学习和记忆能力未见显著性差别。③采用机械分离法分离出胚10d C57/BL6小鼠皮层NSCs,并利用加入生长因子B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12(1:1)培养基成功地进行了NSCs的培养和传代。采用Nestin、β-Tublin、MAP-2、GFAP进行鉴定证实培养的细胞有阳性表达,说明我们分离、培养的细胞为NSCs,而且具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。进一步利用构建的腺病毒载体pAdEasy-VIP进行感染神经干细胞实验证实腺病毒载体pAdEasy-VIP能够感染神经细胞并保持较长时间的表达。定位移植VIP修饰的神经干细胞PS1/APP双转基因小鼠海马后四周仍可见表达EGFP的细胞,其大多分布在针道附近,部分迁移至颗粒细胞层并分化为成年神经细胞,部分细胞向纵深迁移并围绕在Aβ斑块周围。提示我们脑内在体应用神经干细胞作为腺病毒载体不仅能够表达VIP多肽,而且将有望补充丢失的神经元。以上结果证实:血管活性肠肽作为神经免疫的重要调节性多肽,能够有效促进小胶质细胞吞噬Aβ42,抑制Aβ42联合小剂量IFN-γ刺激后NO2-及TNF-α炎症因子的释放以及与抗原呈递功能相关的共刺激分子CD40的表达,通过腺病毒转基因形式的海马定位表达有效的减轻了AD转基因小鼠的Aβ斑块沉积,为研究通过调节小胶质细胞活化减轻AD病变提供了有益的思路。