赤芍和白芍为我国常用中药材。赤芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch.)直接使用的干燥根,白芍为植物芍药水煮去皮后使用的干燥根。芍药苷和芍药内酯苷是赤芍和白芍的两种主要有效成分。本文采用体内和体外研究方法分别对芍药苷和芍药内酯苷进行了代谢研究。通过微生物转化、肠内菌温孵、肝微粒体温孵等技术研究二者的体外代谢,采用HPLC-MS/MS技术分析灌胃给药后的大鼠尿液、胆汁中的代谢物,初步探讨了二者体外模型中的相互转化以及体内和体外研究结果的相关性。同时对芍药苷和芍药内酯苷与人、大鼠的血浆蛋白结合率进行了测定。本研究对明确芍药苷和芍药内酯苷体内过程进而阐述白芍和赤芍药材的体内行为具有重要意义,为中药的代谢研究做出了有价值的探索。第一部分芍药苷和芍药内酯苷微生物转化研究目的:研究芍药苷和芍药内酯苷的微生物转化,分离鉴定转化产物。方法:从18种真菌中筛选出分别对芍药苷和芍药内酯苷有转化能力的菌株,从中各选出1株转化能力强的菌株进行转化放大实验,分别采用硅胶、ODS填充柱色谱和制备高效液相色谱等技术分离纯化转化产物,通过HPLC-MS和NMR技术鉴定转化产物结构。结果:对芍药苷和芍药内酯苷转化能力较强的菌株分别是短刺小克银汉霉AS 3.970和总状共头霉AS 3.264。在短刺小克银汉霉AS 3.970对芍药苷的转化液中分离得到了芍药内酯苷,在总状共头霉AS 3.264对芍药内酯苷的转化液中分离得到了芍药苷。结论:特定条件下,芍药苷和芍药内酯苷可以相互转化。第二部分芍药苷和芍药内酯苷肠内菌代谢研究目的:通过离体实验研究大鼠肠内菌对芍药苷和芍药内酯苷的代谢,体外制备代谢产物并确定其化学结构。方法:分别将芍药苷和芍药内酯苷加至大鼠新鲜粪便中,于无氧条件下培养1、2、6、10、12、18、24、30、36 h时,吸取1 mL用等量的乙酸乙酯萃取3次,涡旋混匀后取上层液氮气吹干,残渣用甲醇溶解后取样20μL经0.45μm微孔滤膜滤过后用于HPLC-MS分析,并根据在各自最大吸收波长时积分所得峰面积和标准曲线求得芍药苷和芍药内酯苷的含量,其他代谢物为相对含量。再分别取一定时间点的转化液经高效液相色谱法制备与纯化,回收有机溶剂后冻干分别得到芍药苷转化产物M1和芍药内酯苷转化产物M2,采用核磁共振波谱进行结构确证。结果:转化曲线的结果表明,芍药苷1 h后已经开始转化,转化产物M1的量不断增大,到24 h达到转化平衡,30 h时已经开始转化成其他代谢物;芍药内酯苷2 h时已经开始发生化,转化产物M2在30 h时达到平衡,后转化为其他代谢物。HPLC-MS和NMR的分析表明芍药苷可被大鼠肠内菌代谢成芍药内酯苷,芍药内酯苷可被大鼠肠内菌代谢成芍药苷。结论:芍药苷和芍药内酯苷在大鼠肠内菌群的作用下可以发生互相转化。第三部分芍药苷和芍药内酯苷肝微粒体代谢研究目的:研究芍药苷和芍药内酯苷经肝微粒体温孵后的代谢产物。方法:根据文献报道的方法将芍药苷和芍药内酯苷分别加入微粒体温孵液中,温孵一定时间后,处理并采用HPLC-DAD分析,确认代谢物。结果:经过多次实验,在大、小鼠肝微粒体中均未发现芍药苷和芍药内酯苷的代谢物。结论:肝微粒体对芍药苷和芍药内酯苷的代谢作用微弱。第四部分HPLC-MS/MS初步分析大鼠尿液和胆汁中芍药苷和芍药内酯苷的代谢物目的:分析推测芍药苷和芍药内酯苷在大鼠尿液和胆汁中的代谢产物。方法:分别灌胃给予雄性SD大鼠芍药苷和芍药内酯苷药液后,收集24 h内的尿液,用等量乙酸乙酯萃取3次,氮气吹干,残渣用甲醇100μL溶解,取样用于HPLC-MS分析;胆管插管收集24 h内胆汁,直接浓缩,0.45μm微孔滤膜过滤后,取样用于HPLC-MS分析,分析推测代谢物。结果:在口服芍药苷的大鼠尿中检测到6种代谢产物,推测其分别为单氧化、三氧化、单甲基化、双甲基化、与水结合和葡萄糖苷酸化的产物。在口服芍药内酯苷的大鼠尿中检测到7种代谢产物,推测其分别为去甲基化、双氧化、与1分子葡萄糖结合和双氧化、与1分子葡萄糖结合、与2分子葡萄糖结合和发生谷胱甘肽反应反应的产物;同时在胆汁中也发现了5种代谢产物,分别为去甲基化、双氧化、三氧化、与1分子葡萄糖结合、葡萄糖苷酸化的产物。结论:HPLC-MS/MS法可以快速、简捷、准确地分析在芍药苷和芍药内酯苷大鼠体内的代谢产物。体内和体外分析的结果表明二者存在一定的联系。在体外微生物和肠内菌的代谢模型中芍药苷和芍药内酯苷发生了相互转化,说明所选的药用真菌和肠内菌中含有相同的酶系;而在体内尿液和胆汁中未见这种转化,可能是含有的酶不同,也可能是其他原因,有待进一步研究。第五部分芍药苷和芍药内酯苷体外大鼠和人血浆蛋白结合率的测定目的:建立芍药苷和芍药内酯苷在大鼠血浆和人血浆中蛋白结合率的测定方法。方法:采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率,将透析液置冰箱内(温度约4℃)平衡透析,确定48 h即可透析至平衡。采用高效液相色谱法测定血浆中药物总浓度和游离药物浓度,计算血浆蛋白结合率。结果: 1、5、10、15、20、30μg/ml的芍药苷与大鼠血浆蛋白结合率分别为60.45 %、67.60 %、78.66 %、74.07 %、76.29 %、74.27 %;1、5、10、15、20、30μg/ml的芍药内酯苷与大鼠血浆蛋白结合率分别为58.94 %、78.54 %、80.82 %、82.43 %、80.36 %、79.63 %。10μg/ml的芍药苷和芍药内酯苷与健康人血浆蛋白结合率分别为82.32 %和85.65 %。结论:芍药苷和芍药内酯苷与大鼠和人血浆蛋白均具有较强的结合,随着血浆中药物浓度升高,芍药苷和芍药内酯苷结合率均升高,具有一定的浓度依赖性。