第一部分2型糖尿病骨折患者肿瘤坏死因子-α上调机制的相关研究目的:检测2型糖尿病患者骨折后静脉血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量,并与非糖尿病骨折患者和糖尿病非骨折患者比较,为研究2型糖尿病患者炎症因子及趋化因子在骨折愈合过程中的作用垫定基础。方法:自2014年9月-2015年10月在内蒙古医科大学第二附属医院骨科就诊的患者中,随机选取28例2型糖尿病骨折患者(其中6例胫骨骨折,11例胫腓骨骨折,11例股骨骨折),同时选取25例非2型糖尿病骨折患者(其中4例胫骨骨折,12例胫腓骨骨折,9例股骨骨折)作为对照组1;另外选取22例糖尿病非骨折患者;全部患者在进行研究前均签署患者知情同意书,全部实验过程通过内蒙古医科大学第二附属医院伦理委员会伦理审核。三组患者均在接诊后立刻抽取静脉血标本。全血标本离心分离血清,按照说明书操作步骤利用酶联免疫吸附试验定量测量hs CRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES,其主要操作有,孵育酶标板,分别加入三组的血清,并依次加入封闭液,牛血清,标准血清,分别加入hs CRP,IL-1β,TNF-α,IL-6,IP-10和RANTES辣根过氧化物酶的多克隆抗体,最后在450 nm波长下,用分光光度计测量其OD值。人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham’s F12的基质和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培养液中培养,培养液中添加2.5 m M左旋谷酰胺和0.3 mg/ml G418,并且添加10%小牛血清h FOB 1.19,细胞在5%CO2,37°C环境下温箱中培养。其中高糖环境造模方法为,将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α,以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。依据产品说明书,用TRIzol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂盒提取人类成骨细胞MG-63的m RNA,最后添加1μl RNasin?Plus RNase Inhibitor的终止液,用Takara One Step RT-PCT kit检测TNF-α和IL-1βm RNA的含量,TNF-α(PF:5’-TCT CAT CAG TTC TAT GGC CC-3’,PF:5’-GGG ATG AGA CAA GGT ACA AC-3’),IL-1β(PF:5’-AAG CTG AGG AAG ATG CTG-3’,PR:5’-ATC TAC ACT CTC CAG CTG-3’)和β-actin(PF:5’-TGT ACG CCT CTG GCC GTA CC-3’,PR:5’-GAT GGG CAC AGT GTG GGT GA-3’),每个反应循环中反应20μL溶液中包含4μL 5x RT-PCR Buffer,1μL d NTP Mix,2μL RNA,0.5μL forward/reverse primer(10μM),0.5μL RNase inhibitor,反转录过程中,42°C孵育5分钟,95°C反应10秒,后95°C,5秒后60°C 20秒重复40个循环,??Ct法定量测量TNF-α和IL-1β比β-actin的相对量。参照细胞浆的蛋白用和细胞裂解液(Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白,并辅以蛋白酶抑制剂(罗氏生化试剂盒,巴塞尔,瑞士)。待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点被3%的小牛血清进行封闭、阻断并在4°C过夜,然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体和a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时,然后接种用过氧化物酶标记的抗兔Ig G抗体在室温下封闭1小时。最后,用化学免疫发光(ECL)检测系统检测其特异性结合。TNF-α和IL-1β水平用其与GAPDH相对灰度值表示。结果:1、2型糖尿病骨折患者前炎症细胞因子的上调为了研究2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律,本研究测量了2型糖尿病骨折、非骨折和骨折非糖尿病患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES含量的变化,并进行组间比较,实验前患者的基线资料在性别、年龄体重指数、患病时间和空腹血糖水平均进行比较,三组间各项指标间差异均无统计学意义。血清hs CRP的水平,2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者,同样,促炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的水平也是2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者,组间比较差异均有统计学意义,IP-10和RANTES的水平与以上因子规律相同,2型糖尿病骨折患者高于糖尿病非骨折患者和骨折非糖尿病患者,差异具有统计学意义,由以上结果说明,高糖可以促进骨折患者炎症相关因子升高。2.高糖诱导成骨细胞MG-63产生肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β规律的研究为了进一步研究2型糖尿病患者促进前炎症因子和趋化因子分泌增多的机制,我们进一步在m RNA和蛋白水平研究了高糖诱导成骨细胞TNF-α和IL-1β的水平变化,我们分别用5,10,20和40 m M的葡萄糖与成骨细胞MG-63共培养12小时,利用RT-q PCR和ELISA的方法测量其相关指标。我们发现TNF-α的m RNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高,其中40 m M葡萄糖组最高,为(2.823±0.2751),其次为20m M葡萄糖组为(1.680±0.1589),不同浓度组间比较,差异具有统计学意义,且TNF-α的m RNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性;IL-1βm RNA会随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的的增高而增高,其中40 m M葡萄糖组最高为(4.574±0.4457),其次为20m M葡萄糖组为(2.847±0.1775),不同浓度组间比较,差异具有统计学意义。TNF-α的m RNA的含量与葡萄糖的浓度呈计量依赖性,以上两类因子在蛋白水平的表达规律与在m RNA水平一致,不同浓度组间比较差异均具有统计学意义。结论:1.2型糖尿病患者前炎症因子和趋化因子的变化规律为2型糖尿病骨折患者血清中hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,IP-10和RANTES的含量大于2型糖尿病非骨折患者,前两者大于骨折非糖尿病患者。2.TNF-α和IL-1β在m RNA水平和蛋白水平随着成骨细胞培养的葡萄糖浓度的增高而增高,其中40 m M葡萄糖组最高,其次为20m M葡萄糖组,不同浓度组间比较,差异具有统计学意义。TNF-α和IL-1β的m RNA的含量和蛋白水平与葡萄糖的浓度呈计量依赖性。第二部分体外高糖干扰肿瘤坏死因子-α介导成骨细胞凋亡机制的研究目的:检测在不同浓度葡萄糖干扰下肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞MG-63凋亡的规律,并通过基因敲除的方法将成骨细胞TNF-α片段敲除,检测对成骨细胞凋亡和凋亡相关因子表达的影响,为研究2型糖尿病患者TNF-α在骨折愈合过程中的作用分子机制及防治骨折不愈合垫定基础。方法:将人类成骨细胞MG-63在1:1混合Ham’s F12的基质和Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培养液中培养,培养液中添加2.5 m M左旋谷酰胺和0.3 mg/ml G418(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA),并且添加10%小牛血清h FOB 1.19,细胞在5%CO2,37°C环境下温箱中培养。高糖环境造模方法,将细胞在5%CO2和氧气混合气体中培养并在培养基中分别加入D-glucose和TNF-α,以造高糖干扰和高糖TNF-α干扰成骨细胞模型。用MTT法检测人类成骨细胞MG-63细胞活力,以下简单描述MTT法,将85%细胞浓度的人类成骨细胞MG-63均匀种植在96孔板上,分组并用5,10,20 or 40 m M D-glucose,和5,10,20 or 40 ng/m L TNF-α共培养24,48和72小时,然后在每个孔中加入10μL MTT试剂,37°C下孵育4小时,再每个孔加入100μL DMSO后,在波长570 nm下,用ELISA plate仪测量各组的吸光度。用annexin V-FITC apoptosis detection试剂盒检测MG-63细胞的凋亡,1×106的MG-63细胞,用annexin V-FITC and propidium iodide试剂盒进行染色,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平,其结果用凋亡细胞比全部细胞的比值表示。参照细胞裂解液(Cell Signaling Technology Inc.,Danvers,MA,USA)使用说明书提取细胞蛋白,并辅以一蛋白酶抑制剂(罗氏生化试剂盒,巴塞尔,瑞士)。待检测各类蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点被3%的小牛血清进行封闭,阻断并在4°C过夜,然后用TNF-α和IL-1β的兔多克隆抗体或a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2小时,然后接种用过氧化物酶标记的抗兔Ig G抗体在室温下封闭1小时。最后,用化学免疫发光(ECL)检测系统检测特异性结合。细胞色素c,cleaved caspase3蛋白和lyzed PARP蛋白水平用其与GAPDH相对灰度值表示。结果:1.肿瘤坏死因子-α和葡萄糖降低成骨细胞MG-63活力机制本部分我们设想肿瘤坏死因子-α和葡萄糖能够诱导降低成骨细胞MG-6活力,因此我们通过MTT实验检测在不同浓度的肿瘤坏死因子-α和葡萄糖干扰下,细胞活力的变化,我们发现,用40 m M的葡萄糖培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降,同样,在20和40 ng/m L的肿瘤坏死因子-α培养成骨细胞MG-63可以使细胞活力急剧下降,不同浓度组间差异具有统计学意义。当用20 m M的葡萄糖培养成骨细胞时,10 ng/m L肿瘤坏死因子-α可以显著性降低成骨细胞MG-6活力;当用20 m M的葡萄糖培养成骨细胞时,20和40 ng/m L肿瘤坏死因子-α成骨细胞MG-6的活力水平比0和10 ng/m低,组间比较差异具有统计学意义,细胞活力与肿瘤坏死因子-α呈计量依赖性;为了进一步研究葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对成骨细胞活力影响的交互作用,我们将5 m M D-glucose培养组设置为对照组,单纯20 m M D-glucose培养组,单纯20 ng/m L TNF-α培养组和既有20 m M D-glucose又有20ng/m L TNF-α混合组间成骨细胞活力进行比较,我们发现,单纯20 m M D-glucose组和单纯20 ng/m L TNF-α组间成骨细胞活力变化差异无统计学意义,同时有20 m M D-glucose和20 ng/m L TNF-α干扰组成骨细胞活力在细胞培养48和72后显著性下降,差异与其他组间具有统计学意义2.肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导成骨细胞MG-63凋亡及相关凋亡蛋白的研究为了进一步研究肿瘤坏死因子-α促进葡萄糖诱导的成骨细胞凋亡机制,我们将实验分为三组,分别为单纯肿瘤坏死因子-α组,单纯葡萄糖组和肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组,单纯葡萄糖组中,20 m M D-glucos与5 m M D-glucose诱导成骨细胞凋亡差异无统计学意义,然而在20 m M D-glucos中再加入20 ng/m L TNF-α并培养24小时和48小时后,会使成骨细胞凋亡显著性上调,差异具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率均大于与其他组,其组间差异均具有统计学意义;同时我们又利用免疫印迹的方法检测了各组间细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleaved caspase 3蛋白和lyzed PARP蛋白含量的变化,单纯20 m M葡萄糖培养成骨细胞不会影响其凋亡蛋白细胞色素c,cleaved caspase 3蛋白和lyzed PARP蛋白含量的变化,如果将20 m M葡萄糖再加入20 ng/m L TNF-α培养成骨细胞,可以显著性的促进成骨细胞分泌细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleaved caspase 3蛋白和lyzed PARP蛋白,组间比较差异具有统计学意义。结论:1.葡萄糖和肿瘤坏死因子-α与成骨细胞MG-6的活力呈计量依赖性。2.D-glucose与TNF-α共同干扰成骨细胞48和72后,活力显著性下降。3.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡率显著大于与单纯干扰组。4.肿瘤坏死因子-α+葡萄糖组导致成骨细胞凋亡相关蛋白细胞色素c,cleaved caspase 3蛋白和lyzed PARP蛋白含量显著大于与单纯干扰组。