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利用本实验室构建的黄喉拟水龟SMART全长cDNA文库,筛选得到转铁蛋白(Transferrin, Tf)基因全长cDNA序列,Tf基因cDNA全长2437 bp,5’UTR(Untranslated region, UTR)长47 bp,3’UTR长212 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为2121 bp,编码706个氨基酸组成的多肽链,分子量为76.76 kDa,理论等电点为7.19。该多肽链由一个19个氨基酸构成的信号肽(19 AA),及两个相似结构域构成,每个结构域包含两个亚基,它们相互作用形成一个深的、亲水的铁结合位点。其基因组DNA由17个外显子和16个内含子组成,与其他脊椎动物Tf基因结构相似,显示了黄喉拟水龟Tf基因在结构上的保守性。同源性分析表明,黄喉拟水龟的Tf基因与鸟类、爬行类的Tf基因同源性最高,约为75%-97%;与哺乳类Tf基因的同源性约为65%-75%;与爪蟾等两栖类的Tf基因也有一定的同源性。荧光定量PCR结果显示,黄喉拟水龟人工感染粘质沙雷氏菌后,Tf基因在其肝脏、脾脏、肾脏及心脏各组织中的表达量均有上调的趋势,这与其他动物经病原刺激后的表达特征具有相似性。根据黄喉拟水龟转铁蛋白(Mauremys mutica Cantor Transferrin,MaTf)的cDNA全长序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从黄喉拟水龟肝脏组织中获得MaTf的成熟肽的基因序列。将所得的成熟肽基因序列插入到克隆载体pMD18-T中,得到的重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入pET-32a表达载体T7启动子控制下的6-His·Tag编码基因上游,构建原核表达质粒pET-32a-Tf表达质粒并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出带有MaTf的融合蛋白。经His Bind柱亲和层析纯化融合蛋白,纯化后融合蛋白分别对粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌进行琼脂糖扩散抑菌试验。实验结果表明重组黄喉拟水龟转铁蛋白对不同的菌抗菌活性有所不同,其中尤以对金黄色葡萄球菌抑菌作用明显,反映出黄喉拟水龟的转铁蛋白与其他铁蛋白一样,在抗菌活性作用上均表现为对革兰氏阳性菌抑制作用比革兰氏阴性菌要明显些。以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体。序列分析表明,MaTf的成熟肽基因序列成功插入到表达载体pET-32a中。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和Western blot分析显示,表达的融合蛋白相对分子质量约为97 kD,与目的蛋白大小一致,并与带His标签的单克隆抗体呈特异性反应。经His Bind柱纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。所制备的多克隆抗体可以与从黄喉拟水龟组织中提取的总蛋白发生反应,经Western blot实验后得到单一的条带。实验结果显示成功获得了黄喉拟水龟MaTf蛋白,并成功制备了高效价、高特异性、高亲和力的抗MaTf的多克隆抗体。为建立能检测龟体内源性MaTf的免疫检测法、放射性免疫法、酶联免疫吸附法等打下了基础,为探索转铁蛋白在黄喉拟水龟非特异性免疫反应中的作用提供了重要信息。