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目的:
1.建立肝性脑病(HE)动物模型;
2.观察肝性脑病模型组和对照组大鼠脑海马中神经元的变化及一氧化氮合酶的表达;
3.探讨海马神经元的形态学改变及一氧化氮(NO)在肝硬化和肝性脑病发病机制中的作用。
方法:雄性Wistar大鼠50只购自河北医科大学河北省实验动物中心,3-4月龄,体重150-200克,实验开始前所有动物均进行Morris水迷宫测试(MWM),之后随机抽出10只动物作为对照组,对照组常规喂养,每周腹下注射生理盐水2次。剩余动物40只为实验组,实验组给予40%CCL4、橄榄油混合溶液腹部皮下注射,5%乙醇自来水溶液自饮。首次给药每只鼠0.5ml/100g,以后每只0.3ml/100g,每周注射2次,共9周。实验第9周(肝硬化晚期)用Morris水迷宫测试动物的学习、记忆、空间认知能力,根据测试结果选出为阳性的动物再进行脑电图(EEG)测试,出现脑电频率变慢,5-8次/秒,以宽大的δ波为主,电压高达150-300μV;再结合血液生化指标及实验过程中活动观察,可以确立实验性肝硬化模型建立。成功建立CCL4肝性脑病模型14只,分两组大鼠肝、海马组织进行HE染色、尼氏染色及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-黄递酶(NADPH-d)染色。通过肝组织HE染色,确定肝硬化的形成;用尼氏染色法观察海马中神经元的变化;经烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-黄递酶(NADPH-d)染色法观察海马一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元的变化。用图像分析仪对海马神经元进行光密度及数目测定同时对海马一氧化氮合酶(NOS)的表达程度和数目进行定量分析并与对照组相比较。
结果:
1)肉眼下可见模型组肝脏普遍肿大,表面较粗糙,有较粗的颗粒,暗红色;正常组肝脏未见异常。肝组织光镜切片显示正常组肝组织肝小叶结构完整,肝板条索状以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞无变形坏死。模型组肝内有大量纤维增生,肝细胞溶解,弥漫性大片坏死,残留肝细胞成片气球样变。
2)与对照组大鼠比较,造模组第九周水迷宫测试逃避潜伏期明显延长,以潜伏期延长超过正常x+2.5s为标准,本实验有14/20(55%)只大鼠水迷宫潜伏期明显延长;
3)肝性脑病模型组结果显示,大鼠ALT、TBil、BUN及BA水平明显高于正常对照组,组间比较有显著性差异;
4)对照组脑电图以α波为主,无明显异常;肝性脑病模型组出现肝性脑病变化,脑电频率变慢,5-8次/秒,以宽大的δ波为主,电压高达150-300μV。
5)尼氏染色结果:光镜下可见染为蓝色的神经元。对照组大鼠尼氏染色切片上,神经元数目较多、色深,可见深蓝色尼氏体,细胞核淡蓝色;而相同区域内实验组大鼠海马神经元数目减少、染色较浅,胞浆内尼氏体减少或溶解,树突肿胀、断裂,胞体较对照组圆。
6)NADPH-d染色结果:海马内一氧化氮合酶(NOS)神经元着色,颜色从紫蓝、深蓝到浅蓝不等。光镜下分布为:一氧化氮合酶阳性神经元及纤维散在分布于海马结构各部分,以海马锥体层和齿状回颗粒层较为密集,多为二极及多极神经元。实验组可见粗大轴突着色,树突联系广泛;对照组则少有粗大轴突着色,树突间联系不如实验组广泛。实验组一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元染色较对照组深,为紫蓝或深蓝色(强阳性及阳性),且阳性神经元数目较多;而对照组染色浅淡,呈浅蓝或与背景同色,为弱阳性。
结论:
1.建立了肝硬化合并肝性脑病较为理想的动物模型;
2.实验性肝硬化大鼠第九周后肝性脑病的发生率为70.0%,是慢性肝病中一种发生率很高的并发症,水迷宫测试联合检测更易检出;
3.肝性脑病大鼠海马内神经元数目减少,胞体内尼氏体减少或消失;一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元染色较对照组深,数目较多;说明肝性脑病时海马一氧化氮(NO)可能介导了神经元的损伤并参与了肝性脑病的发病。
4.通过对肝性脑病模型组大鼠所表现出来的学习、记忆、空间认知力障碍、情绪异常、睡眠障碍等症状的研究,可以认为肝性脑病患者以上的临床表现有可能和海马的结构受损伤有关,从而进一步验证海马的功能与情绪、学习、记忆和睡眠觉醒密切相关。