目的本研究拟从细粒棘球绦虫（Eg）原头节中扩增出Eg95和EgA31抗原编码基因,再通过基因拼接法（Gene SOEing）将两个单基因融合,构建Eg95-EgA31融合基因,并将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,将该重组质粒电穿孔转化两歧双歧杆菌（Bb）以及大肠埃希菌BL21（DE3）,构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗,研究Eg95-EgA31融合基因在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率,探讨重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫反应的动态变化和对Eg原头节攻击的保护力及其免疫机制,为囊型棘球蚴病（CE）的防治提供一种安全高效的新型疫苗。方法1.从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用Gene SOEing法剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,再将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,将该重组质粒电穿孔转化Bb,构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗;将该重组质粒电穿孔转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。2.为了研究重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后不同时间点小鼠体内体液免疫和细胞免疫的变化,将重组Bb-Eg95-EgA31疫苗口服灌胃或鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠,免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20w用ELISA法检测血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,流式细胞术（FCM）检测脾CD₄⁺和CD₈⁺ T细胞百分率。3.为了研究重组Bb-Eg95-EgA31疫苗对Eg原头节攻击的保护力及其免疫机制,将重组Bb-Eg95-EgA31疫苗皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种或口服免疫BALB/c小鼠,免疫后8周,用50个Eg原头节经腹腔注射攻击,以空质粒、Bb或MRS作对照,25周后处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重减少率,ELISA法检测血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平及脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,FCM检测脾CD₄⁺和CD₈⁺ T细胞百分率,Annexin V-FITC染色法检测脾细胞凋亡发生率。结果1.琼脂糖凝胶电泳证实Eg95（471bp）、EgA31（500bp）抗原编码基因和Eg95-EgA31融合基因（1016bp）扩增成功;双酶切证实重组质粒pGEX- Eg95-EgA31构建成功;PCR证实重组Bb-Eg95-EgA31疫苗构建成功;SDS-PAGE证实重组质粒pGEX-Eg95-EgA31在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导后能够表达分子量为62.5KDa左右的重组Eg95-EgA31融合蛋白,IPTG诱导3～5h重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的18%,Western blot证实该融合蛋白具有特异的抗原性。2.动态观察表明:与0周未免疫小鼠相比,口服免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8～10周、2～20周、2～20周、4～8周、6～12周和10周显著升高,分别在免疫后8、2、6、6、8和10周达最高水平;脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～16周、2～12周、2～6周和4～12周显著升高,分别在免疫后4、2、4和6周达最高水平;脾淋巴细胞增殖水平在免疫后4～10周显著升高,在免疫后6周达最高水平;脾CD₄⁺ T细胞在免疫后4～10周显著升高,在免疫后6周达最高水平,CD₈⁺ T细胞无明显变化。鼻腔粘膜接种组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后4～10周、4～20周、2～20周、2～12周、4～12周和10～12周显著升高,分别在免疫后10、6、10、8、8和10周达最高水平;脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～8周、2～12周、2～8周和6～16周显著升高,分别在免疫后2、2、4和8周达最高水平;脾淋巴细胞增殖水平在免疫后4～8周显著升高,在免疫后6周达最高水平;脾CD₄⁺ T细胞在免疫后4～8周显著升高,在免疫后6周达最高水平,CD₈⁺ T细胞无明显变化。3.疫苗免疫加用Eg原头节攻击后发现,皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔粘膜接种组和口服免疫组的囊重减少率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;与对照组相比,免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平显著升高,IgG3和IgE水平显著降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平显著升高,IL-10水平显著降低;脾淋巴细胞显著增殖;脾CD₄⁺和CD₈⁺ T细胞显著增加;脾细胞凋亡发生率显著降低。鼻腔粘膜接种和口服灌胃是两种较好的免疫途径,且前者优于后者。结论1.通过RT-PCR成功扩增出Eg95和EgA31抗原编码基因。2.通过Gene SOEing法成功扩增出Eg95-EgA31融合基因。3.成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31。4.成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗。5.细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95-EgA31能在BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,表达效率为18%,且表达的重组Eg95-EgA31融合蛋白具有特异的抗原性。6.重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答反应。7.重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的保护性免疫应答,从而对抗Eg原头节的攻击。其诱导的保护力以鼻腔粘膜接种和口服免疫组最强,而鼻腔粘膜接种组优于口服免疫组。