论文部分内容阅读
目的：研究MACC1、c-Met、微血管密度(Microvascular density, MVD)在NSCLC中的表达及相关性,探讨三者与NSCLC临床病理特征(特别是与淋巴结转移和血管生成)之间的关系；并进一步通过鸡胚尿囊膜实验和NSCLC细胞实验研究MACC1基因对NSCLC血管生成的影响及相关分子作用机制。方法：1.MACC1、c-Met、MVD在NSCLC中的表达及相关性研究,探讨三者与NSCLC临床病理特征之间的关系：收集手术切除后的NSCLC组织50例,采用免疫组织化学方法检测癌组织和癌旁正常组织中的MACC1、c-Met、MVD (CD34标记)表达情况,分析其与临床病理特征之间的关系及三者的相关性。2. NSCLC细胞系中MACC1的mRNA水平的测定：培养5株NSCLC细胞,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测MACC1基因在所培养的5株NSCLC细胞中的相对表达水平；3.沉默MACC1基因表达对NSCLC细胞促血管生成的影响及其作用机制研究：选择MACC1基因高表达肺癌细胞系XWLC-05,使用化学合成的MACC1-siRNA瞬时转染XWLC-05细胞,经相关检测有效沉默细胞中MACC1基因表达的基础上,分别于转染细胞0小时,24小时,48小时,72小时后收集培养细胞上清液,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于转染72小时后收集各实验组细胞上清液,通过鸡胚尿囊膜实验检测各实验组血管生成情况,同时提取各实验组细胞总蛋白,Western-blot方法检测MACC1下游信号通路关键蛋白分子Met、p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相对表达量。4.MACC1基因过表达对非小细胞肺癌促血管生成的影响及其作用机制研究：搜索Genebank中人MACC1的基因序列,自Thermo Scientific公司购买MACC1 cDNA克隆质粒进行扩增,经双酶切后将目的基因MACC1序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的PIRES2-EGFP表达载体,经测序检测成功构建PIRES2-EGFP-MACC1表达质粒,将已构建成功的PIRES2-EGFP-MACC1表达载体瞬时转染人MACC1基因低表达肺腺癌细胞系SPC-A1,分别于转染细胞0小时,24小时,48小时,72小时后收集培养细胞上清液,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF, IL8的分泌水平,于转染72小时后收集各实验组细胞上清液,通过鸡胚尿囊膜实验检测各实验组血管生成情况,同时提取各实验组细胞总蛋白,Western-blot方法检测MACC1下游信号通路关键蛋白分子Met、 p-MEK/MEK、p-Erk/Erk和p-Akt/Akt的相对表达量。结果：1.50例NSCLC组织中MACC1、c-Met阳性表达率分别为68%、64%,与相应癌旁正常组织阳性表达率(32%,36%)相比差异有统计学意义(P<0.05); MACC1、c-Met阳性表达在NSCLC组织中表达呈正相关,与NSCLC的临床分期、有无淋巴结转移有关；NSCLC组织中MACC1、 c-Met阳性组MVD值高于MACC1、c-Met阴性的肺癌组织(P<0.05),相关性分析得出MACC1、c-Met的表达与MVD值存在相关性(P<0.05)；2. RT-qPCR显示五株NSCLC细胞中宣威肺腺癌细胞XWLC-05 MACC1 mRNA表达水平最高,肺腺癌细胞SPC-A1 MACC1 mRNA的表达水平最低；3.化学合成的3组MACC1-siRNA均能沉默XWLC-05细胞中MACC1基因的表达,选择抑制效率最高的MACC1-siRNA3组应用于后续实验,其结果提示：MACC1 siRNA转染XWLC-05细胞后,鸡胚尿膜囊实验显示MACC1-siRNA干扰组鸡胚尿囊膜新生血管面积较无义siRNA组及空白对照组减少(P<0.05)：ELISA检测结果显示于48和72小时所提取细胞培养上清液中的VEGF、bFGF和IL-8细胞因子的表达水平明显被抑制(P<0.05)；Western-blot检测结果显示NSCLC细胞中的Met、p-MEK和p-ERK表达水平显著降低(P<0.05),但总MEK和ERK蛋白表达无明显差异,AKT及其磷酸化蛋白水平均未受影响。4.成功构建PIRES2-EGFP-MACC1表达载体,经测序鉴定序列完全正确,转染SPC-A1细胞后荧光显微镜下可见清晰的绿色荧光表达,RT-PCR检测结果显示转染PIRES2-EGFP-MACC1的SPC-A1细胞能够稳定表达MACC1 mRNA,与转染PIRES2-EGFP (Vector)组和空白对照组相比,转染PIRES2-EGFP-MACC1组SPC-A1细胞MACC1 mRNA的表达量明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。鸡胚尿膜囊实验显示转染PIRES2-EGFP-MACC1组可见稍多的血管分支,鸡胚尿囊膜新生血管面积较PIRES2-EGFP (Vector)组及空白对照组相比增多,差异具有统计学意义(p<0.05)；Western-Blot检测结果显示PIRES2-EGFP-MACC1转染组SPC-A1细胞c-Met表达水平显著增加,MAPK信号通路的关键蛋白因子p-MEK和p-Erk略有增加(P<0.05),总MEK和Erk蛋白量没有变化,而AKT及其磷酸化水平蛋白未受影响,ELISA结果显示与PIRES2-EGFP (Vector)组及空白对照组相比,转染PIRES2-EGFP-MACC1组SPC-A1细胞上清液中血管生成相关因子VEGF, bFGF和IL8的分泌水平在24小时时基本一致,但48h和72小时后上述三个因子的表达水平明显增长(P<0.05)。结论：1.NSCLC组织中MACC1、c-Met在NSCLC发生和转移中可能起重要作用,结合临床分期对非小细胞肺癌患者病情评估及预后判断有一定的指导意义。2. NSCLC组织中MACC1、c-Met的表达与MVD值存在相关性,说明MACC1、c-Met的表达可能与NSCLC的血管生成有关。3.MACC1基因能够影响NSCLC细胞诱导鸡胚尿膜囊微血管形成的能力,其机制可能与MACC1通过影响NSCLC细胞中的HGF/c-Met及其下游MEK/ERK信号通路,调控细胞中血管生成相关因子VEGF、bFGF和IL8等分泌有关。