1944年以来,氨基糖苷类抗生素临床应用走过了漫长的道路,细菌也产生了更强的耐药性。氨基糖苷类抗生素耐药机制包括：抗生素乙酰化,腺苷化或磷酸化；细菌外膜通透性改变,使胞内抗生素浓度降低,减少内膜运输,主动外排,药物诱捕；30S核糖体亚基作用位点突变；抗生素结合位点甲基化等。而诱导抗性基因的表达成为当前抗生素耐药的主要问题。AAC(6’)-IIb位于荧光假单胞菌的染色体上,该基因表达使细菌对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和西索米星产生抗性。我们命名其5’-UTR非翻译区序列为aac, aac可翻译成短肽,具有ermC、fexA一样的性质。vienna RNA结构在线分析显示,aac在不同温度下呈现不同结构,说明其不同结构可能会影响AAC(6’)-IIb的表达。为研究aac的功能,构建报告基因pGEX-aac-lacZa表达载体,选用具有代表性的氨基糖苷类结构模型kanamycin B, lacZ酶活显示加入kanamycin B组酶活升高,证实其能诱导lacZa的表达。而荧光定量PCR发现lacZa转录水平上,加抗生素组比对照组有稍微上调,推测可能是mycin B与aac转录产物作用后,稳定aac的结构进而导致lacZa的稍微上调。不同浓度kanamycin B不引起lacZa转录产物的变化,推测kanamycin B组与对照组aac-lacZa实际上没有转录产物表达变化,只有aac转录产物二级结构的变化。neomycin与gentamycin进一步验证lacZ酶活与lacZa转录产物,结果与kanamycinB相同,推测氨基糖苷类抗生素能与aac结合,进而诱导lacZa的表达。平板诱导实验直观展示lacZa表达情况,除spectinomycin外所用13种氨基糖苷类抗生素均能诱导报告基因表达,推测spectinomycin结构中没有氨基或者其结构未与aac结合,进而导致lacZa表达无变化。SPR实验验证aac RNA结合,并获得结合常数。SPR实验需要aac RNA3’末端标记生物素,经验证标记过程RNA无明显降解,标记效率高,产量多。进一步体外SPR实验证明,aac RNA能与除spectinomycin外氨基糖苷类抗生素结合,而结合常数与抗生素结构中氨基位置和结构有关。RNA与小分子结合调控相关基因表达为“核开关”的定义,而ermC、fexA翻译后停靠调控具体机制仍未知,因为在体外前导肽不能与相对应抗生素结合,因此核开关理论可能适合ermC、fexA(?)(?)aac。构建pGEX-RmtB-aac-lacZa报告载体,16S rRNA甲基化,平板诱导实验显示除spectinomycin外氨基糖苷类抗生素仍能诱导lacZa的翻译,证明aac与氨基糖苷类抗生素直接结合,aac是以氨基糖苷类抗生素为配体的核开关。抗性基因表达菌株诱导环状大小不明显,推测修饰后的核糖体影响了lacZa的翻译,而所需抗生素诱导浓度较高,推测16SrRNA甲基化后氨基糖苷类抗生素结合aac的体内浓度降低,具体机制需进一步研究。aac作为核开关,其与氨基糖苷类抗生素结合前后应有结构改变。SHAPE实验证实,氨基糖苷类抗生素与aac RNA结合后使翻译起始SD-2及AUG-2结构打开,而spectinomycin不与之结合。通过vienna在线预测RNA结构及CLUSTALW同源性比对分析发现,aac结构中存在一段保守序列AGUC与16SrRNA相同,推测结合位点可能发生在相关位置。经SHAPE数据分析发现,靠近AGUC位置的“CCC"序列信号下降,证明其可能与氨基糖苷类抗生素结合,因此推测其为氨基糖苷类抗生素的结合位点。通过数据分析,预测出aac加抗生素前后的结构,而参与结合位点的反应基团还有待进一步研究。综上所述,本课题发现一个新核开关aac,配体为氨基糖苷类抗生素,这也是首次报导抗生素为配体的核开关,为抗性基因诱导表达的机理研究开辟了一个新的领域。硫化氢是第三大气体信号分子,参与血管张力,心肌收缩,神经传递和胰岛素的分泌调节。当体内缺少硫化氢时,观察到动脉和肺动脉高压,阿尔茨海默病,胃粘膜损伤和各种动物模型肝硬化。外源硫化氢可改善心肌功能障碍与缺血相关／再灌注损伤,降低胃粘膜损伤。另一方面,对其过度表达可能导致炎症性疾病,感染性休克,脑中风,唐氏综合征患者心理障碍的发病,其表达的减少可能对这些疾病的治疗有潜在价值。目前对硫化氢的研究还处于初步阶段,对硫化氢作用的分子机制及直接作用的靶分子至今不明。为了阐明硫化氢细胞效应的分子机制与调控网络,并进一步通过硫化氢途径干预重大疾病寻找新的靶点,我们运用裂殖酵母生物芯片的方法,选用覆盖全基因组编码序列的裂殖酵母的生物芯片,对比在细胞内有硫化氢和没有硫化氢的条件下全基因组表达谱的差异,为分离出参与细胞周期,细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子做铺垫。经过相关实验验证和分析,采用50μM硫氢化钠为硫化氢的供体,处理后的裂殖酵母进行全基因组RNA提取,反转录后基因芯片杂交。信号采用SAS分析系统标准化,2-fold, t-test分析筛选到83个差异表达基因,1.5-fo1d筛选到280个差异基因。经cluster分析发现,三个生物重复实验具有重复性,实验结论可靠。而采取的1.2-fold变化基因的实时荧光定量PCR分析发现,基因芯片数据可信度高,所以我们采用1.5-fold为主要分析所用基因。采用DAVID在线软件对差异表达基因进行功能分类,默认设置(counts>2, EASE score＜0.1),2-fold基因GO生物过程分类显示,有20个下调基因,63个基因上调。1.5—fold的基因中,有156个基因表达上调,124个基因表达下调。其中2-fold中31个基因与应激反应相关,18个基因编码预测的或已知的运输蛋白,11个基因编码与细胞周期/减数分裂相关的蛋白质,10个基因编码的蛋白质参与氧化还原反应。与应激相关基因的比较发现,硫化氢诱导基因中46%的基因与过氧化氢相同,43%的基因与镉相同,49%的基因与热相同。然而,只有12%和24%硫化氢诱导基因与山梨醇和甲基甲烷磺盐相同。与过氧化氢相同基因可能说明硫化氢可以保护细胞免受氧化应激,参与MAPK信号通路中的一些基因的表达变化可能是硫化氢的靶基因。在全基因组蛋白定位研究中,4954个基因中的480个基因定位在线粒体(9.6%基因定位在线粒体)。大于1.5倍基因中124个基因下调,而其中定位在线粒体的基因有23个受硫化氢处理下调(18.5%基因定位于线粒体)。表明硫化氢引起许多线粒体基因表达下调,可能对线粒体功能的有影响。通过检测裂殖酵母的呼吸中的耗氧量和线粒体膜电位来验证硫化氢对线粒体功能的影响,实验结果表明,硫化氢处理后的裂殖酵母耗氧量降低,线粒体膜电位下降,证明线粒体功能损伤,这充分印证基因芯片数据分析结果,硫化氢引起线粒体基因表达下调。硫化氢引起的一些基因差异表达可为人类同源蛋白质研究和分子靶点提供线索,为进一步探索与硫化氢相关的人类疾病机理和治疗提供基础。