论文部分内容阅读
J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是1989年被分离、鉴定出的一个新的禽白血病病毒亚群,与其它ALV亚群比较,该亚群病毒的一个显著特点是其env基因非常独特。ALV-J env基因与其它亚群的同源性很低,但是与正常存在于鸡体内的内源性EAV-HP序列有高达97%的同源性。该亚群病毒主要引起髓细胞瘤,而其它外源性ALV亚群主要引起淋巴瘤。ALV研究资料表明其致瘤性与env密切相关。为了进一步研究Env蛋白的功能和在致瘤中的作用,本研究首先构建了一个表达ALV-J env基因细胞系,并发现了该细胞具有类转化现象;进一步研究发现Env蛋白中存在与信号转导相关的基序;根据基序功能,首次提出将ALV-J Env蛋白分为三类,即抑制型、双功能型以及激活型Env蛋白;并提出了ALV-J Env蛋白致病致瘤理论;同时对双功能型env基因进行了克隆、表达,建立了检测ALV-J Env抗原/IgG免疫复合物的ELISA方法。 一、表达J亚群禽白血病病毒env基因细胞系的构建 将ALV-J 4817毒株env基因插入pcDNA3.1真核表达载体构建成转移载体pcDNA-env。用转移载体pcDNA-env转染鸡胚成纤维细胞系,通过抗Zeocin药物基因筛选获得转染阳性细胞。阳性细胞经传30代后,冻存,13个月后复苏,置不含药物的培养基中传代培养。连续传40代后,分别用PCR、Southern-blot、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot对细胞中的env基因进行了检测,并进行了抗病毒感染分析。试验结果表明,通过Zeocin药物筛选获得了稳定表达ALV-J env基因的鸡胚成纤维细胞系,命名为pcDNA-env-DF1细胞;该细胞在体外抗ALV-J感染试验中,能抵抗10~4个TCID50病毒感染。这一细胞系的构建对进一步探索env基因功能具有重要意义。扬州大学博士学位论文二、J亚群禽白血病病毒Env蛋白功能与PI3K相关 稳定表达Al入l-J 4817毒株Env蛋白的peDNA.env一DFI细胞的生长形态特性研究表明,该细胞形态与正常细胞相比明显变圆、变大,提出其可能是一种类转化现象。利用3D矛SSM软件以及TMpred软件分别对4817毒株Env蛋白进行了分析,结果表明4817毒株Env蛋白具有信号转导功能,而且发现4817毒株Env蛋白胞浆区存在PI3K信号激活结构域Y尤月讨。用PI3K特异性抑制剂对peDNA·env-DFI细胞处理后发现,该细胞类转化形态能被逆转,证明peDNA-env一DFI细胞类转化现象直接与PI3K信号有关,提示4817毒株Env蛋白具有潜在的致瘤性,其机理可能通过胞浆区YxxM结构域激活PI3K,引起peDNA-env-DFI细胞的类转化,有关研究正在深入。三、J亚群禽白血病病毒Bnv蛋白分类及其特性 对不同ALV一J Env蛋白胞浆区氨基酸序列进一步比较发现,ALV一J毒株Env蛋白胞浆区除了YxxM结构域外,还存在ITIM和类ITAM结构域。根据Y双M、ITAM和mM作用和功能,作者提出将ALV一J Env蛋白分为抑制型、双功能型以及激活型三类。根据这一分类原则,在检索到的33个ALV一J Env蛋白中,有28个为双功能型Env蛋白,3个为抑制型Env蛋白,只有4817和UD3毒株2个为激活型Env蛋白;而检索到的所有EAV.HP均属于抑制型Env蛋白。 Env蛋白的抗原性分析发现,抑制型、双功能型以及激活型Env蛋白的胞浆区抗原性依次降低,但致病、致瘤能力越来越强,这种现象与其信号转导基序直接相关。分析ITIM基序对控制或抑制免疫细胞激活、增殖功能,提示抑制型、双功能型Env蛋白中ITIM基序与ALV一J免疫抑制相关,抑制型Env蛋白与EAV一HP可能是ITIM受体,EAV一HP可能为细胞内原癌基因,ALV一J env可能为病毒癌基因。四、J亚群禽白血病病毒双功能型即y墓因克隆及其表达 通过组织病理检查、组织切片特异性抗原检测、细胞培养技术以及间接免疫荧光试验佃A)从一疑似ALv一J感染的祖代肉用型种鸡群中分离、鉴定到一株ALV一J病毒,命名为Js.Nt毒株。随后对该毒株的env基因进行了PCR扩增、克隆、序列分析、转移表达质粒构建以及表达。结果表明,该毒株Env蛋白胞浆区存在Y双M和ITIM结构域,属于ALV一J双功能型Env蛋白;用该毒株env基因以及peDNA3.1载体成功构建了转移表达质粒PcDNA.NT.env;通过peDNA一T一e。