论文部分内容阅读
植物内生真菌因其能产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物,一直是筛选具有新型生物活性物质的重要资源。海南粗榧作为药用植物,以产抗肿瘤活性成分三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱化合物而出名。本研究以海南粗榧为研究对象,对分离自海南3个地区的179株海南粗榧内生真菌进行抗菌活性筛选,并对高抗菌活性菌株进行菌种鉴定,随后对高抗菌活性菌株进行抗肿瘤活性筛选,并对其次级代谢产物化学成分进行初步测定,确定目标菌株。之后对目标菌株次级代谢产物进行分离纯化,并解析单体化合物的结构,最后对单体化合物的抗肿瘤活性进行测试。主要内容如下：抗菌活性筛选采用菌饼法,以大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae HYXY08)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani ZLL101)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum XJSO1)和香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum RKY102)共7株病原菌为测试菌,对179株海南粗榧内生真菌进行抗菌活性筛选,共筛出15株高抗菌活性菌株。采用形态学与分子生物学鉴定(18SrDNA-ITS)的方法,将15株具有高抗菌活性的内生真菌鉴定为Trametes polyzona A8、Diaporthe kyushuensis A24、 Diaporthe kyushuensis A25、Penicillium copticola A29、Albonectria rigidiuscula B18、Corynespora cassiicola B29、Nemania diffusa B33、Colletotrichum tropicicola D4、Colletotrichum thailandicum E4、Phomopsis asparagi F26、Periconia sp. F31、 Colletotrichum magnisporum F32、Diaporthe actinidiae F45、Phomopsis fukushii F75以及Phomopsis fukushii F91。其中,Albonectria rigidiuscula和Colletotrichum magnisporum是首次从三尖杉属(Cephalotaxus)植物中分离到的内生真菌。随后,采用MTT法,以3株白血病细胞系(人慢性髓原白血病细胞系K562,人急性早幼粒白血病细胞系NB4,人急性髓原白血病细胞系HL-60)以及人肝癌细胞系HepG-2和人结肠癌细胞系LoVo作为测试肿瘤细胞系,对15株高抗菌活性菌株的次级代谢产物粗提物进行抗肿瘤活性筛选。发现15株内生真菌都至少对一株肿瘤细胞系具有细胞毒活性。特别是Penicillium copticola A29显示出了极强的抗肿瘤活性,对5株测试肿瘤细胞系都显示出了较强的细胞毒活性。继而,对15株高活性菌株的次级代谢产物化学成分进行初步测定,结果显示菌株Penicillium copticola A29的次级代谢产物中可能含有包括甾体及三萜类等6类物质,其代谢产物丰富多样。因此确定菌株Penicillium copticola A29为目标菌株。经过对菌株Penicillium copticola A29的大规模发酵培养,采用硅胶柱层析、HPLC和制备薄层层析相结合的方法,共分离纯化出10个单体化合物。利用现代波谱技术(ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR)解析得到这10个单体化合物的结构,它们为3-Chloro-4-methoxyphenylacetic acid (1)、Vanillic Acid (2)、 dihydrosporogen-AO 1 (3)、3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid (4)、 6-dehydropetasol (5)、phomenone (6)、3:4di-hydroxy-5-methoxyphenylacetic (7)、sporogen-AO 1 (8)、7-hydroxypetasol (9)、Dibutyl phthalate (10)、采用MTT法,以上述5株癌细胞系为测试肿瘤细胞系,对分离得到的10个单体化合物进行了抗肿瘤活性测试,结果显示化合物9对HL-60细胞系显示出温和的细胞毒活性；化合物5对K562和NB4细胞系显示出一定的细胞毒活性；化合物3、化合物6和8对3株白血病细胞系都具有非常强的细胞毒活性,其中化合物3对K562、NB4和HL-60细胞系的ICso值分别为19.61 μg/mL.59.51 μg/mL和1.93μg/mL;化合物6对K562、NB4和HL-60细胞系的IC50值分别为2.87μg/mL、0.12μg/mL和2.33 μg/mL;化合物8对K562、NB4和HL-60细胞系的IC50值分别为1.76 μg/mL、0.21μg/mL和1.91 μg/mL。除此之外,化合物6和8还对HepG-2细胞系具有一定的细胞毒活性。综上所述,本研究经过抗菌与抗肿瘤活性筛选,成功筛选出1株具有高抗菌与高抗肿瘤活性的菌株Penicillium copticola A29,通过分离纯化其次级代谢产物得到10个化合物,其中化合物dihydrosporogen-AO 1、phomenone和sporogen-AO1对本研究的3株白血病细胞系均显示出非常强的细胞毒活性。因此上述研究为从海南粗榧内生真菌发掘出更多具有高抗菌与抗肿瘤活性成分提供了可靠的实验依据。