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鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种可感染鸭、鹅、火鸡及其他禽类,对养殖业造成巨大经济损失的细菌性病原。喹诺酮药物是目前临床大量使用的药物之一。而近年来,鸭疫里默氏菌对喹诺酮药物的耐药情况愈发严重。本研究在对RA分离株进行耐药表型检测的基础上,探究了RA对喹诺酮类药物的耐药机制,主要结果如下:1.鸭疫里默氏菌对喹诺酮类药物的耐药表型检测本文首先测定162株鸭疫里默氏菌对第一代喹诺酮药物萘啶酸及第三代喹诺酮药物环丙沙星、恩诺沙星和氧氟沙星四种抗生素的MIC值。相比1979年前的分离株,1979年后的分离株大多对三种氟喹诺酮类药物的抗性明显提升。我们选择了分离自2013~2018年、来自48个养殖场的137株鸭疫里默氏菌进行了喹诺酮耐药情况分析,结果发现,137株鸭疫里默氏菌临床分离株对上述四种喹诺酮药物的耐药比率分别100%(137/137)、97.8%(134/137)、99.3%(136/137)及97.8%(134/137)。2.鸭疫里默氏菌DNA促旋酶和Ⅳ型拓扑异构酶耐药突变作用对37株全基因组测序菌株进行序列比对,汇总各菌株gyr A、gyrB、par C、parE基因上的突变位点。并利用PCR扩增剩余125株菌株上述基因片段,比对分析各菌株的基因突变及氨基酸替换情况。结果显示,高频突变位点主要有GyrA中第83位氨基酸,包括两种突变类型S83R和S83I,总突变频率为93.2%,第465位氨基酸C465R,突变频率为42.6%;在ParC中第586位氨基酸,包括两种突变类型:V586T和V586A,总突变频率为41.4%,第799(V799A)位氨基酸,突变频率为72.2%,第811位氨基酸I811V,突变频率为67.3%;在ParE中第357(V357I)、358(H358Y)、541(R541K)、564(D564K)位氨基酸突变频率分别为80.9%、80.9%、82.1%、44.4%。利用体外诱导突变技术获得喹诺酮耐药突变株,并利用定点突变和自然转化技术分别构建鸭疫里默氏菌高频位点定点突变株与过表达菌株,结果显示,诱导突变仅分离得S83R突变株,其对萘啶酸MIC上升了8倍,对三种氟喹诺酮药物MIC上升512-1024倍;定点突变株只有ATCC 11845 gyrA(S83I)和ATCC 11845 gyrA(S83I)+parE(V357I+H358Y+R541K)两株对三种氟喹诺酮类抗生素的MIC有4~8倍上升,但对萘啶酸MIC无明显变化,其余定点突变株对四种喹诺酮药物的MIC无明显变化;过表达菌株与亲本菌株相比,其MIC无显著改变。3.鸭疫里默氏菌对喹诺酮类药物外排作用研究利用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(VP)两种外排泵抑制剂对鸭疫里默氏菌全基因组测序菌株中的24株菌株进行外排泵抑制试验,与未加入外排泵抑制剂的MIC结果相比,RA RCAD0131、RCAD0181以及RCAD0377株对三种氟喹诺酮药物敏感性明显下降,表明喹诺酮耐药相关外排泵参与了鸭疫里默氏菌对喹诺酮类药物的抗性机制。综上,本研究检测了RA对喹诺酮类药物的耐药情况,并证明靶位点突变及喹诺酮相关外排泵共同介导鸭疫里默氏菌对喹诺酮类药物的抗性。