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目的:乳腺癌是常见的恶性肿瘤,不仅具有复发率高,转移率高及死亡率高的特点,其发病率也在逐年增加。随着社会的发展科学的进步,近年来乳腺癌的治疗已经取得了一定的进展。虽然乳腺癌外科手术治疗取得了良好的治疗效果,但术后的放疗、化疗及靶向治疗,依然是乳腺癌综合治疗的不可缺少的部分,因此探讨乳腺癌细胞耐受化疗的机制以及开发新的化疗药物一直是乳腺癌研究的重要内容。临床试验表明以蛋白酶体为靶点的药物具有良好的抗肿瘤作用,但是研究显示肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂类化疗药物也会产生耐受治疗的现象,而且这与自噬有着密切的关系。自噬是细胞内由溶酶体介导的蛋白质和细胞器降解过程,在正常情况下,自噬被限制在基本水平范围内,但是在饥饿以及细胞内外环境变化的刺激下,自噬便被激活。虽然研究提示自噬与内质网应激有密切的关系,但以往的研究还很局限,尚未对其中的机制进行研究,因此我们在课题组结合文献提出假设:蛋白酶体抑制剂可能部分通过内质网应激通路激活了自噬;抑制与自噬相关的上游内质网应激信号通路能够增强蛋白酶体抑制对细胞的杀伤效果。我们将通过实验探究内质网应激在蛋白酶体抑制剂诱导的乳腺癌MCF-7细胞自噬的作用。方法:本研究以乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,选择蛋白酶体抑制剂MG-132,自噬抑制剂3-MA和内质网应激抑制剂Salubrinal为作用药物进行了实验。本实验分为空白对照组,MG-132组,MG-132+3-MA组和MG-132+Salubrinal组,通过MTT法检测各组对MCF-7细胞活性的影响,采用免疫蛋白印迹法检测各组自噬相关蛋白LC3表达水平,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平及内质网应激相关蛋白Grp-78、GADD153和Caspase-12的表达水平的检测,选择流式细胞检测仪检测各组对MCF-7细胞的凋亡作用的差异,使用RT-PCR法比较各组内质网应激相关基因Grp-78、GADD153和Caspase-12的m RNA水平,从而研究内质网应激在MG-132诱导的MCF-7细胞自噬的作用,探讨自噬与内质网应激在MG-132杀伤MCF-7细胞中的重要调控作用。结果:1MG-132对MCF-7细胞具有活性抑制作用,随着浓度的升高和作用时间的延长作用增强,呈浓度依赖性与时间依赖性,各组浓度抑制作用3小时开始,6小时开始明显,48小时最明显,MG-132浓度为2.5μmol/L作用48小,抑制率为17.4%,当浓度为10μmol/L与40μmol/L作用48小时,抑制率分别达到48.6%与96.3%,通过SPSS17.0软件计算得出MG-132在48小时的IC20值约为2.5μmol/L,。低浓度3-MA对乳腺癌MCF-7细胞没有明显增殖抑制作用,浓度为1mmol/L作用48小时,抑制率为6.1%,3-MA浓度为10mmol/L与20mmol/L作用48小时,抑制率分别达到46.2%与92.4%,呈浓度依赖性,计算得出3-MA在48小时的IC5值约为1mmol/L。低浓度Salubrinal对MCF-7细胞同样没有明显增殖抑制作用,当浓度为5μmol/L与10μmol/L作用48小时,抑制率分别为4.3%与11.5%,当Salubrinal浓度为40μmol/L与80μmol/L作用48小时抑制率分别达到37.9%与84.8%,呈明显浓度依赖性,计算得出Salubrinal在48小时的IC5值约为5μmol/L。2蛋白酶体的糜蛋白酶样活性检测结果显示MG-132对MCF-7细胞蛋白酶体活性有抑制作用,3h开始细胞内蛋白酶体活性受抑制,抑制率为65%,48h时抑制作用最强,呈明显时间依赖性。与上述MTT实验结果对比,当MG-132作用于MCF-7细胞3h时开始出现抑制,6h抑制明显增加,而蛋白酶体活性于3h时抑制率约为65%,呈现明显抑制作用,提示先出现蛋白酶体活性的抑制,再出现细胞增值的抑制。3自噬抑制剂3-MA(1mmol/L)增强MG-132(2.5μmol/L)对细胞的增殖抑制作用,且随着时间的延长作用增强,48小时的抑制作用最明显,呈时间依赖性。Salubrinal(5μmol/L)增强MG-132诱导的MCF-7细胞抑制作用,呈时间依赖性,作用48小时后细胞抑制最明显,与3-MA相比,其细胞增殖抑制作用相对较弱,二者差异48h时最明显。4MG-132(2.5μmol/L)能够诱导MCF-7细胞的凋亡与G2期细胞阻滞,凋亡率为10.6%,G2期细胞百分比为22.40%。3-MA(1mmol/L)和Salubrinal(5μmol/L)增强MG-132诱导的细胞凋亡与G2期细胞阻滞,凋亡率增加至23.3%和24.7%,G2期细胞百分比提高至24.80%和25.76%。5MG-132(2.5μmol/L)诱导MCF-7细胞自噬,自噬抑制剂3-MA(1mmol/L)明显抑制细胞自噬,阻滞LC3-I至LC3-II的转化。内质网应激抑制剂Salubrinal(5μmol/L)降低LC3-I的表达,抑制LC3-I至LC3-II的转化过程,显示自噬抑制作用,但作用弱于3-MA。6与MG-132(2.5μmol/L)组相比,3-MA(1mmol/L)和Salubrinal(5μmol/L)下调了抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3显示上调,显示良好的增强MG-132诱导的MCF-7细胞凋亡作用。7MG-132(2.5μmol/L)能够诱导MCF-7细胞内质网应激的产生,内质网应激抑制剂Salubrinal(5μmol/L)能够有效抑制该过程,在蛋白与m RNA水平体现抑制作用。与之相似,3-MA(1mmol/L)也表现良好的内质网应激的抑制作用,在蛋白与m RNA表达上具有明显抑制作用,但作用效果弱于Salubrinal。结论:蛋白酶体抑制剂MG-132可能部分通过内质网应激通路激活了自噬;抑制与自噬相关的上游内质网应激信号通路能够增强蛋白酶体抑制剂MG-132对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用。