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近年来,以热休克蛋白Hsp90为靶目标的苯醌安莎霉素类化合物格尔德霉素(Geldanamycin,GM)及其结构类似物一直是抗肿瘤药物研究领域的热点。GM及其类似物能够通过抑制Hsp90的功能使肿瘤细胞内诸多重要蛋白迅速降解,从而抑制肿瘤细胞的生长和引发肿瘤细胞自发凋亡。 在前期工作中,我们发现一株放线菌新种自溶链霉菌(Streptomycesautolyticus)能够产生大量的格尔德霉素和极微量的自溶霉素。但是,由于对其生物合成过程中的调控机制研究并不透彻,严重妨碍了我们通过遗传改造有效地提高这些化合物的产量并获得新的结构类似物。 为了探明自溶链霉菌中参与格尔德霉素生物合成相关基因的功能和调控机制,我们研究了两个调控基因almRⅠ和almRⅡ在格尔德霉素生物合成中的功能。采用Red/ET一步PCR敲除法在大肠杆菌中成功构建了这两个调控基因的插入突变,然后通过接合转移把所构建的突变导入自溶链霉菌中,经过同源重组获得了almmRⅠ和almRⅡ基因敲除突变株。对突变株的发酵产物分析显示,在敲除almmRⅠ或almRⅡ基因后,突变株均不再产生格尔德霉素,说明almRⅠ和almRⅡ基因在格尔德霉素的生物合成中均起到正调控作用。此外,在敲除almRⅠ和almRⅡ基因后,两株突变株均产生了2个新的化合物。 为了进一步探究almRⅠ和almRⅡ基因在格尔德霉素生物合成中的调控机制,我们表达纯化了AlmRⅠ和AlmRⅡ蛋白,同时PCR扩增了almRⅠ、almRⅡ、almO、almP和almK五个基因的启动子区,然后利用EMSA(Electrophoretic MobilityShift Assay)分析了AlmRⅠ或AlmRⅡ与这五个基因启动子区的结合情况,但均未发现任何滞后现象,表明在现有条件下AlmRⅠ和AlmRⅡ不能与上述基因的启动子区结合,可能不调控这些基因的表达。 为了寻找AlmRⅠ和AlmRⅡ调控的靶基因,我们采用了RT-PCR(ReverseTranscript PCR)对almRⅠ和almRⅡ突变株GM基因簇中所有基因的表达进行了分析,这些基因的表达都不受AlmRⅠ和AlmRⅡⅡ的调控。 本研究的主要目的在于探明调控基因almRⅠ和almRⅡ在格尔德霉素生物合成中的调控机制,该研究有助于我们进一步对产生菌进行遗传改造以提高此类化合物的产量。