背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,是一种累及回肠、直肠和结肠粘膜的慢性非特异性肠道炎症性疾病。IBD可发生于任何年龄,多见于20-49岁,亦可见于老年人或儿童。流行病学研究发现IBD发病率在世界范围内呈现逐渐增高的趋势。我国缺乏大规模流行病学调查,但亦有证据表明其呈逐年上升趋势。由于发病机制尚不明确,临床上常表现为反复发作而治愈难度大。已有的研究证实,遗传易感因素、肠道菌群、粘膜免疫异常以及环境因素共同参与了该病的发生。目前,IBD的主要治疗目的是抑制粘膜炎症,常用药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、抗生素和一些免疫抑制剂。尽管这些治疗方法在很多患者中均取得较好的治疗效果,仍有许多患者不能临床缓解,因此有待研究新的行之有效的治疗方法。结肠炎性巨噬细胞的浸润是IBD的一个重要特征,在IBD的发病中发挥着极为重要的作用。在IBD患者和实验性结肠炎模型中,外周血单核细胞可募集至结肠粘膜,分化成炎性巨噬细胞分泌包括TNFα、IL-1和IL-6在内的促炎性细胞因子。NF-κB信号通路的活化被认为是促炎性细胞因子表达和分泌的强效诱导者,且IBD患者结肠粘膜巨噬细胞中存在明显的NF-κB信号通路活化。此外,巨噬细胞促炎性细胞因子的分泌是IBD的重要发病因素之一。因此,靶向粘膜炎性巨噬细胞的治疗策略可能对研发新的治疗药物有重要的作用和价值。然而,由于缺乏有效的干预方法,针对于结肠粘膜巨噬细胞干预的研究极为有限。氯化钆(gadolinium chloride,GdCl3)已被广泛应用于实验性研究。在实验性动物中已经发现,氯化钆在肝脏中有清除巨噬细胞的作用,在肝损伤等疾病中有预防或治疗的作用。此外,实验性动物中发现氯化钆对巨噬细胞有选择性抑制作用。已经证实,氯化钆对大鼠肺组织巨噬细胞没有清除作用,但可以抑制LPS刺激后TNFα和IL-6的表达。然而,氯化钆对结肠粘膜巨噬细胞的作用知之甚少。目的1.研究应用氯化钆后肠炎小鼠结肠粘膜炎症程度和疾病严重程度。2.探讨氯化钆抑制肠炎小鼠粘膜炎症的机制。3.应用RAW264.7细胞体外验证氯化钆对巨噬细胞活性的抑制作用。方法1.动物处理体重20-25g,周龄8-10周的雄性C57BL/6J小鼠被用于该研究。静脉给予不同浓度的氯化钆,对照组给予PBS。流式细胞术检测小鼠结肠粘膜巨噬细胞的比例。2.肠炎的诱导(1)TNBS灌肠造肠炎模型将2mg的TNBS溶解于50%的乙醇溶液中,终体积为O.1ml。用注射器(0.1m1)吸取配置好的TNBS溶液,随后与一聚乙烯塑料管(内径为1.2mm)相连,用石蜡油充分润滑导管末端后灌肠,导管末端距小鼠的肛门约2-3cm,将注射器内的TNBS缓慢推入结肠。对照组小鼠给予同等剂量的生理盐水。TNBS灌肠后第3天至第7天,用注射器(0.1m1)吸取配置好的氯化钆(10mg/kg体重)溶液灌肠。对照组给予等量的PBS灌肠。在TNBS灌肠后第7天或第14天,处死小鼠。TNBS灌肠后第3天至第7天,用注射器(O.1m1)吸取配置好的氯化钆(10mg/kg体重)溶液,行尾静脉注射。对照组给予等量的PBS灌肠。在TNBS灌肠后第7天或第14天,处死小鼠。(2)DSS诱导肠炎将DSS (40,000MW)溶于饮用水中,使其终浓度为3%(w/v),给予小鼠连续饮用7天,对照组给予正常的饮用水饮用。饮用DSS第3天,用注射器(O.1m1)吸取配置好的氯化钆(10mg/kg体重)溶液,随后与一聚乙烯塑料管(内径为1.2mmm)相连,用石蜡油充分润滑导管末端灌肠,导管末端距小鼠的肛门约2-3cm,将注射器内的氯化钆缓慢推入结肠。对照组给予等量的PBS灌肠。在DSS诱导肠炎后第7天或第14天,处死小鼠。饮用DSS诱导肠炎第3天,用注射器(O.1m1)吸取配置好的氯化钆(10mg/kg体重)溶液,行尾静脉注射。对照组给予等量的PBS灌肠。在DSS诱导肠炎后第7天或第14天,处死小鼠。3.肠炎严重程度评估每日监测小鼠体重,肠炎程度通过疾病活动指数(DAI)进行评估。疾病活动指数评分主要评估体重减轻程度、血便情况和粪便硬度。对每组的每只老鼠进行评估,每一项的评分为0-4分,共计12分。小鼠与诱导炎症后第7天或第14天处死,取结肠标本甲醛固定,对实验设计和操作全盲的医师进行组织学炎症程度评分。4.流式检测结肠粘膜巨噬细胞比例提取结肠粘膜细胞,孵育F4/80抗体,流式检测结肠粘膜巨噬细胞比例。5.血清和结肠粘膜细胞因子水平检测收集小鼠外周血血清,提取结肠粘膜蛋白,ELISA检测TNFα、IL-1β和IL-6水平。6.细胞处理RAW264.7培养于DMEM+10%FBS的培养基中,将RAW264.7种在96孔板中,培养12h后,给予不同浓度的氯化钆分别处理不同时间点。7.氯化钆处理后细胞活性和凋亡的检测上述RAW264.7细胞经氯化钆处理后,加入MTT检测细胞活性。此外,RAW264.7经氯化钆处理24h后,流式检测其凋亡水平。8.LPS刺激细胞检测细胞因子分泌将RAW264.7种在24孔板中,LPS刺激后,ELISA检测TNFα、IL-1β口IL-6的分泌。9. Western blot检测提取小鼠结肠粘膜蛋白和LPS处理的RAW2647细胞蛋白,用BCA法测定浓度,通过SDS-PAGE进行蛋白分离,然后转移到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭后依次行一抗(NF-κB p65抗体)和辣根过氧化物酶标记二抗孵育。ECL化学发光法检测条带。结果1.氯化钆对小鼠结肠粘膜巨噬细胞没有清除作用实验结果表明,静脉应用氯化钆后,小鼠结肠粘膜巨噬细胞比例未见明显改变。此外,血清和结肠粘膜TNFα、IL-1β和IL-6的表达水平未见升高,表明氯化钆无致炎作用。2.氯化钆可缓解TNBS和DSS诱导的肠炎为探究氯化钆在小鼠肠炎模型中的潜在作用,我们应用TNBS和DSS诱导的两种小鼠肠炎模型进行研究。在TNBS诱导的小鼠肠炎模型中,在TNBS灌肠后第3天,给予小鼠尾静脉注射氯化钆。研究结果显示,氯化钆尾静脉注射后肠炎小鼠的死亡率、疾病严重程度、结肠缩短程度和组织学损伤程度均明显改善。TNBS灌肠诱导小鼠肠炎模型后第3天起予氯化钆灌肠至第7天。研究结果显示,氯化钆灌肠后肠炎小鼠的死亡率、疾病严重程度、结肠缩短程度和组织学损伤程度亦均明显改善。而氯化钆尾静脉注射组和氯化钆灌肠组小鼠之间无显著的统计学差异。将DSS (40,000MW)溶于饮用水中,使其终浓度为3%(w/v),给予小鼠连续饮用7天,对照组给予正常的饮用水饮用。在DSS诱导肠炎后第3天,给予小鼠尾静脉注射氯化钆。研究结果显示,氯化钆尾静脉注射亦可显著缓解DSS小鼠肠炎严重程度。DSS诱导小鼠肠炎模型后第3天起予氯化钆灌肠至第7天。研究结果显示,氯化钆灌肠后肠炎小鼠的死亡率、疾病严重程度、结肠缩短程度和组织学损伤程度亦均明显改善。而氯化钆尾静脉注射组和氯化钆灌肠组小鼠之间无显著的统计学差异。3.氯化钆抑制TNBS和DSS诱导的TNFα、IL-1β和IL-6表达TNBS和DSS诱导肠炎后,静脉或经肛给予氯化钆。我们发现,结肠粘膜巨噬细胞比例未见明显改变,但ELISA结果表明肠炎小鼠血清和结肠黏膜TNFα、IL-1p和IL-6的表达水平降低。4.氯化钆降低LPS活化的RAW264.7细胞的促炎性细胞因子分泌氯化钆对RAW264.7细胞无毒性且不诱导其凋亡。给予LPS活化的RAW264.7细胞氯化钆,ELISA结果发现TNFα、IL-1β和IL-6的表达水平均明显降低。5.氯化钆抑制肠炎小鼠结肠粘膜和LPS活化RAW2G47细胞的NF-κB活性给予肠炎小鼠氯化钆,结肠粘膜NF-κB p65的表达明显降低。此外,体外研究发现氯化钆亦能降低LPS活化的RAW264.7细胞的NF-κB p65的表达。结论本研究应用TNBS和DSS构建了两种IBD小鼠肠炎模型,首次发现氯化钆在TNBS和DSS诱导的肠炎模型中可缓解小鼠的死亡率、疾病严重程度、结肠缩短程度和组织学损伤程度,具有显著的保护作用。此外,通过相关机制的深入研究,发现氯化钆主要是通过下调NF-KB信号通路的活性抑制巨噬细胞促炎性细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的分泌从而抑制结肠粘膜炎症以缓解小鼠肠炎的严重程度。因此,干扰粘膜炎性巨噬细胞可能是IBD治疗的新的有前景的靶点。