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背景和目的:血管新生内膜形成是PTCA和支架术后RS的病理基础,VSMC的迁移则是新生内膜形成的关键步骤,必须首先突破ECM的束缚方能穿过内弹力膜发生迁移形成新生内膜。ECM的稳定是维持血管壁完整性的重要基础,MMPs及其组织抑制因子TIMPs是维持ECM稳态最重要的蛋白酶家族。血管损伤后,受损血管局部的VSMC在各种细胞因子的刺激下发生细胞表型的改变,由收缩型转变为合成型,分泌大量的MMPs,打破了维持ECM稳态的MMPs/TIMPs动态平衡,分泌到胞外的MMPs使ECM蛋白发生降解,从而解除了ECM对VSMC的束缚,打通了VSMC迁移的道路,因此,MMPs可能在新生内膜形成过程中扮演了分子开关的角色。由此可见,维持MMPs与TIMPs之间的动态平衡是十分重要的。近年来的一些研究证实,血管损伤时局部过表达TIMP-l、TIMP-2和TIMP-3均可明显减少VSMC迁移、抑制新生内膜增生。TIMP-4作为TIMPs家族的新成员,表达具有心脏特异性。目前关于TIMP-4生物学功能的研究报道较少,是否也会对VSMC的迁移与增殖产生影响,尚未见报道。本实验构建了携带TIMP-4基因的重组腺病毒载体,通过转染体外培养的大鼠VSMC,研究增强其表达对VSMC增殖、迁移等生物学行为的影响,以进一步明确TIMP-4的生物学活性,为TIMP-4在RS防治研究中的应用提供理论依据和实验证据。方法:①采用位置特异性重组方法构建携带人TIMP-4基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体,经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液。将获赠的对照病毒Ad.LacZ以相同方法进行扩增和纯化;②采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMC,以形态学和免疫细胞化学鉴定;③以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、免疫细胞化学和蛋白免疫印迹等方法分别检测TIMP-4基因在VSMC转录和翻译水平的表达;④以酶谱法(zymography)和逆向酶谱法(reverse zymography)检测VSMC表达分泌的TIMP-4的蛋白活性;⑤应用带Matrigel基底膜基质的Millicell培养小室研究TIMP-4表达对VSMC迁移的影响,应用四唑盐(MTT)比色实验、3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入实验、流式细胞仪等检测TIMP-4表达对VSMC增殖的影响; 结果:①应用DNA重组技术,成功构建了携带TIMP-4基因的重组穿梭质粒载体pDC315.TIMP-4,将其与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3cre在脂质体介导下共转染293<WP=8>细胞,通过位置特异性重组,经PCR法筛选、鉴定,成功获得了携带TIMP-4基因的人类5型复制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4。构建的Ad.TIMP-4通过大量复制和纯化,获得滴度约5×1010pfu/ml。对照病毒Ad.LacZ经扩增、纯化,获得滴度为7.5×1010pfu/ml。Ad.TIMP-4和Ad.LacZ的最佳转染复数均为100MOI;②采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMC,经形态学和免疫细胞化学鉴定证实为VSMC,6～8代时VSMC纯度几近100%;③通过RT-PCR、免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹等方法表明,正常培养的VSMC不表达TIMP-4,Ad.TIMP-4转染VSMC后检测TIMP-4细胞表达率、mRNA和蛋白表达的结果均证明VSMC成功表达了TIMP-4,表达率随转染时间延长逐渐增加,转染后2d可达86.5%,高水平的表达可维持6d以上;④酶谱法和逆向酶谱法结果证明Ad.TIMP-4转染VSMC后表达分泌的TIMP-4具有抑制MMPs的生物学活性。在实验过程中对检测TIMP-4生物学活性的酶谱法和逆向酶谱法进行了优化;⑤Ad.TIMP-4转染VSMC后,TIMP-4表达可显著抑制PDGF趋化作用引起的VSMC迁移,并且随转染时间的延长,TIMP-4表达增多,迁移的VSMC数呈更加减少的趋势。与Ad.LacZ组相比,VSMC迁移数最大减少78.7%;⑥Ad.TIMP-4转染VSMC后,TIMP-4表达可显著抑制VSMC增殖。与Ad.LacZ组相比,MTT吸光度降低最大达47.1%,3H-TdR掺入量降低最大达30.7%,G0- G1期的VSMC比例显著增高,G1- M期和S期细胞比例显著降低; 结论:①用构建的复制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4转染培养的大鼠主动脉VSMC, 可使TIMP-4在VSMC中高效表达,并具有生物学活性;②Ad.TIMP-4转染VSMC后,TIMP-4的表达可显著抑制VSMC的迁移和增殖;③TIMP-4对VSMC生物学行为的影响为RS的基因防治研究提供了新的思路;④用改建的PTCA球囊建立了大鼠颈总动脉新生内膜增殖模型,为TIMP-4的体内应用研究奠定了实验基础。