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研究目的来源于胰腺导管上皮细胞的恶性肿瘤占胰腺恶性肿瘤的绝大多数,简称胰腺癌(PC)。各种研究表明PC与胰岛素(INS)关系密切。而INS在由胰岛中的β细胞分泌后,可自由弥散到胰腺的细胞外液中,所以胰腺内存在一个高水平的INS环境。也正因如此,相比其他组织器官中的癌细胞,PC更有被INS影响的条件,研究PC与INS相关的分子机制具有十分深远的意义。目前已知INS有两个同源受体:胰岛素受体(IR)和胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)。当INS与IR、IGF1R结合后可使两受体发生磷酸化(p-)而被激活,从而激活下游的两条信号通路。其中的一条信号通路包含丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt),而另一条信号通路则包含MAPK激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK)等。这两条信号通路的激活,可激活下游各种效应蛋白,如已糖激酶(HK-Ⅱ)、磷酸果糖激酶(PFK-1)、葡萄糖转运体(Glut-1),从而促进癌细胞的糖酵解和能量生成,有助于癌细胞的生长。此外,INS还与细胞内的缺氧诱发因子1(HIF-1)关系密切。HIF-1是一个二聚体转录因子,由α和β两个亚基组成。正常氧浓度下,细胞中的HIF-1α一经生成便在有氧调节下被降解,所以哺乳动物的正常细胞中只能检测到HIF-1β,检测不到完整的HIF-1。而癌细胞却能异常表达HIF-1α进而表达HIF-1,HIF-1可使相关靶基因转录加快,由这些基因编码的蛋白包括糖酵解酶(如HK-Ⅱ、PFK-1)、葡萄糖转运体(如Glut-1)、血管上皮生长因子(VEGF)等,从而促进癌细胞的生长和转移。在前期工作中,笔者通过体外实验发现INS可使PC细胞两个INS受体(pIR、p-IGF1R),两个下游蛋白(p-AKT、p-ERK),还有HIF-1α及其效应蛋白(HK-Ⅱ、PFK-1、Glut-1、VEGF)的表达增强,从而促进癌细胞的糖酵解,促进癌细胞的生长。所以,本研究试图用链脲佐菌素(STZ)干预小鼠体内的INS水平,用IR拮抗剂——五没食子酰基葡萄糖(β-PGG)干预体内的INS受体水平,验证胰腺内的INS是否也通过INS受体后信号通路及HIF-1α影响PC细胞的生长。研究方法实验一:给予普通小鼠小剂量(25μg/g、50μg/g)的STZ单次腹腔注射,4周后检测小鼠的随机血糖,用ELISA检测门静脉血和胰腺中的INS含量,用免疫组织化学染色(IHC)检测胰岛中内分泌细胞的数量;实验二:给予PC荷瘤鼠STZ(50μg/g)单次腹腔注射和β-PGG(20μg/g·day)持续灌胃给药8周。实验结束后,对小鼠实体瘤进行称重并沿肿瘤最大横截面对半切开,一半用H&E染色和TUNEL染色进行组织学分析,另一半用Western blot检测IR、IGF1R、HIF-1α及下游各效应蛋白的表达情况。研究结果(1)两种剂量(25μg/g、50μg/g)的STZ均没有使普通小鼠体质量下降或随机血糖升高至糖尿病标准(随机血糖≥13.8 m M)。但是,普通小鼠门静脉血中和胰腺内的INS水平下降,胰腺β细胞的数量也随着STZ剂量的增加呈剂量依赖性的降低。(2)STZ和/或β-PGG虽不能使PC荷瘤鼠的实体瘤重量减小,但可使肿瘤组织中的活细胞面积减小,坏死细胞面积增加。Western blot分析则发现,STZ和/或β-PGG可使肿瘤组织中两个INS受体(IR、IGF1R),下游Akt、MEK、ERK以及HIF-1α表达水平下降,可使各效应蛋白HK-Ⅱ、PFK-1、Glut-1、VEGF表达水平下降,还可使3个细胞凋亡相关蛋白(PARP、BAX、c-cas3)表达增强,并且两者联合作用的效果更明显。研究结论(1)小剂量(≤50μg/g)的STZ在不使小鼠构成糖尿病的前提下,可仅仅造成胰岛部分β细胞的破坏,从而长期、稳定地造成胰腺内INS水平下降;(2)与体外实验一致,体内的INS也可通过影响两个INS受体(IR、IGF1R)和下游Akt、MEK-ERK两条信号通路的活性及HIF-1α的表达,继而影响肿瘤细胞的糖酵解及血管的生成,最终影响肿瘤细胞的生长;(3)INS是传统医学中“脾气”和“肾气”在“水谷精微”的转输和利用方面的功能结合体;(4)本研究在体内研究INS对PC的影响,为传统医学主张以“脾”论治PC提供了现代医学佐证,并且在PC的中医治疗中增加对“肾”的调理,或许为PC的中医治疗发展开辟了一条新思路。