刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是重要的机会性致病原虫,广泛寄生于人体及动物的组织细胞内,引起人兽共患病。据美国华盛顿大学医学院的流行病学家调查研究估计,人类每四个人中就有一人感染弓形虫,但通常只有免疫功能低的人才会因为感染弓形虫而表现出临床症状。免疫系统正常的人也有可能因此患上严重的眼部疾病或中枢神经系统疾病,女性可造成所怀胎儿的先天性缺陷或死亡。随着分子生物学技术在寄生虫学研究领域的应用和发展,弓形虫疫苗从最早的全虫疫苗到新近迅速发展起来的核酸疫苗均取得了很大进展。但是弓形虫灭活疫苗免疫保护力低,减毒活疫苗有恢复毒力的风险,不能用于人体,而基因工程多肽疫苗的制备费用高、抗原性弱、制备过程复杂,因此,研制一款安全、有效的抗弓形虫疫苗对于保护易感人群以及促进人类优生优育具有重要意义。弓形虫的顶端复合体在虫体侵入宿主细胞过程中起着重要的作用,其中对棒状体的研究较为广泛、深入。作为棒状体蛋白家族成员之一的ROP18被认为是目前发现的最有可能与弓形虫入侵人体并在宿主细胞内存活、大量繁殖有关的影响因子。因此,本文以刚地弓形虫RH株棒状体蛋白ROP18为研究对象,探讨其是否具有抗原性及免疫保护作用。首先提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,通过PCR扩增棒状体蛋白18(TgROP18)基因。扩增产物经双酶切后连接到原核表达载体pET30a(+),建立重组表达载体pET30a(+)-TgROP18,将重组质粒转化大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAG)分析重组蛋白TgROP18的表达情况,同时以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白的免疫反应性。实验结果显示,PCR扩增获得TgROP18基因,长约1665bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果进一步验证重组质粒ET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE实验证实,经IPTG诱导可获得相对分子质量(Mr)为59800的可溶性重组蛋白TgROP18。最终经Western blotting分析,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。确定融合蛋白His-ROP18成功表达后,诱导小鼠抗攻击感染实验。将60只5-6周龄的雌性Balb/c小鼠,体重(18～20)g左右,随机分成4组,每组15只。分别接种His-TgROP18-FCA(A组)、His-TgROP18(B组)、弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant,FCA)(C组)和PBS(D组)。经腹腔注射,免疫剂量50μ/只,时间顺序为0d-20d-34d。每次免疫前尾部静脉采血,收集血清进行细胞因子水平测定。最后一次免疫后1周,对所有小鼠经腹腔注射感染含弓形虫速殖子103-5个/只,通过观察小鼠生存率及免疫前后细胞因子白介素17(interleukin-17,IL-17)、γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、白介素10(interleukin-10, IL-10)和白介素4(interleukin-4, IL-4)水平的变化分析弓形虫RH株ROP18蛋白的作用及机制。结果A组小鼠IL-4浓度均值54.17ng·L-1, IL-10浓度均值106.88ng·L-1, IL-17浓度均值5.02ng·L-1, INF-γ浓度均值166.96ng·L-1; B组小鼠IL-4浓度均值52.56ng-L-1, IL-10浓度均值103.34ng·L-1, IL-17浓度均值4.99ng·L-1, INF-γ浓度均值142.42ng·L-1; C组小鼠IL-4浓度均值73.06ng·L-1, IL-10浓度均值144.40ng·L-1, IL-17浓度均值13.34ng·L-1, INF-γ浓度均值73.64ng·L-1; D组小鼠IL-4浓度均值68.29ng·L-1, IL-10浓度均值145.29ng·L-1, IL-17浓度均值14.97ng-L-1, INF-y浓度均值76.50ng·L-1。经统计学软件单因素分析可知免疫后小鼠与对照组(B、C)相比,实验组(A、B)小鼠细胞因子IFN-γ水平明显升高(P<0.05),而IL-10. IL-4. IL-17水平有所降低(P<0.05),这些表现均符合各项细胞因子的生物学特点。后经抗感染免疫攻击实验,实验组小鼠与对照组小鼠中位生存期时间6～7d相比,其中位生存时间延长至22～25d。以上实验结果证实了：1.本实验室成功克隆TgROP18基因,构建重组原核表达载体pET30a(+)-TgROP18;2.重组蛋白TgROP18具有特异的抗原性；3.重组融合蛋白His-TgROP18对小鼠进行免疫后能诱导小鼠机体产生较强免疫应答,这为进一步研究弓形虫疫苗以及该蛋白的生物学功能提供实验基础。