论文部分内容阅读
目的:术后肠梗阻是一种较为常见的医源性并发症,是由于腹腔手术中对小肠的机械性操作引起的。炎症机制是引起术后肠梗阻发生和发展重要原因。P38/MK2信号通路是介导细胞应激免疫炎症反应的一条重要信号传导通路,现已研究证实HuR(人抗原R)在P38/MK2信号通路中对多种炎性因子的mRNA在转录后水平具有调节作用。在本实验中,我们将研究HuR与术后肠梗阻联系,观察慢病毒介导的RNA干扰小鼠肠壁HuR是否能有效预防和减轻术后肠梗阻的发生,并进一步探讨HuR在P38/MK2信号传导通路中的调控作用。方法:1.建立携带绿荧光蛋白的空载慢病毒转染小鼠模型。实验动物C57BL/6小鼠,按以下方式随机分组,空白对照组(A)(n=5):小鼠腹腔注射1.5ml生理盐水组。LV-GFP1组(慢病毒-绿荧光蛋白1,B)(n=5):1*10^8GTU LV-GFP 50μl,用1.5ml 0.9%生理盐水稀释后小鼠腹腔注射。LV-GFP2组(慢病毒-绿荧光蛋白2,C)(n=5):1*10^8 GTU LV-GFP 100μl,用1.5ml 0.9%生理盐水稀释后腹腔注射。LV-GFP3组(慢病毒-绿荧光蛋白3,D)(n=5):1*10^8 GTU LV-GFP 200μl,用1.5ml0.9%生理盐水稀释后腹腔注射。常规喂养28天后,无菌操作原则下,打开腹腔,荧光灯下直接观察小鼠肠管慢病毒转染情况。并取自然状态下空肠远端长约2cm处肠管组织若干份。利用-80℃冰箱保存及福尔马林中固定部分组织,运用HE染色、GFP免疫组化、GFP mRNA检测和GFP蛋白检测等方法确定慢病毒腹腔转染小鼠小肠的最佳效应滴度,并建立模型。2.建立术后肠梗阻小鼠模型。实验动物按以下分组,A组(对照组):不实施手术操作,仅仅打开腹腔后应用生理盐水纱布保护肠管,10分钟后逐层关腹;B组(手术组):手术操作诱发术后肠梗阻;C组(慢病毒组):腹腔注射Hur-RNAi慢病毒,常规喂养28天后操作如A组;D组(手术+慢病毒组):腹腔注射HuR-RNAi慢病毒,常规喂养28天后进行操作如B组。四组小鼠在手术操作后24小时进行取材,收集小肠组织标本及血清标本进行相关检测。RT-PCR检测前炎性基因的表达。ELISA检测血清炎症因子的表达。免疫组化染色检测小肠肠壁组织中炎性细胞的浸润。石蜡切片的HE染色检测小肠的形态学改变。体外肌电图检测小肠的蠕动功能。蛋白质免疫印迹技术检测小肠组织磷酸化及总的MK2蛋白,细胞质内和总的HuR的表达情况。观察干扰HuR基因表达后,对术后炎症反应的影响。并进一步探讨HuR在P38/MK2中的作用。结果:1.慢病毒转染小鼠模型在荧光显示器下,空白对照组无显色,LV-GFP1组,LV-GFP2组和LV-GFP3组小鼠小肠肠壁组织均有显色,肉眼观察LV-GFP1显色较弱,LV-GFP2和LV-GFP3无明显区别。GFP免疫组化显示,对照组小鼠肠壁无明显染色,LV-GFP1组,LV-GFP2组和LV-GFP3小鼠小肠肠壁组织均有显色,LV-GFP1显色较弱,LV-GFP2和LV-GFP3无明显区别。小鼠肠壁HE染色,四组小鼠肠组织均未见小肠绒毛萎缩及明显细胞坏死脱落、炎症细胞及成纤维细胞浸润。RT-PCR检测GFP-mRNA、Western blot检测GFP蛋白表达,对照组无GFP表达,LV-GFP2组及LV-GFP3组较LV-GFP1均表达增强,LV-GFP2和LV-GFP3无统计学差异。2.小鼠术后相关指标检测对比:A组与B组小鼠肠壁中炎症细胞、前炎性基因的表达及血清中炎症因子表达的比较,B组A组,p<0.05,具有统计学意义。A组与C组炎症细胞、前炎性基因的表达及血清中炎症因子表达的比较,p>0.05无统计学意义。B组与D组小鼠肠壁中炎症细胞(常驻巨噬细胞除外)、前炎性基因的表达及血清中炎症因子表达的比较,B组D组,p<0.05,具有统计学意义。A组与B组中,磷酸化MK2的比较,B组A组,p<0.05,具有统计学意义,总的MK2蛋白比较,p>0.05,无统计学差异,胞浆中的HuR蛋白对比,B组A组,p<0.05,具有统计学意义。细胞中的HuR蛋白总量比较,p>0.05,无统计学差异。A组与C组磷酸化的MK2的含量、MK2蛋白总量及胞浆中HuR蛋白含量的比较,p>0.05,均无统计学差异。HuR蛋白总量比较,A组C组,p<0.05,具有统计学意义。B组与D组中,磷酸化的MK2的对比,B组D组,p<0.05,具有统计学意义;MK2蛋白总量,p>0.05,无统计学意义;胞浆中及总的HuR含量对比,B组D组,p<0.05,并具有统计学意义。结论:1、慢病毒可有效安全转染小鼠肠壁组织,并抑制肠道HuR表达,其最佳效应剂量100μl1.0×108GTU。2、HuR参与调节术后肠梗阻炎症反应的发生、发展。3、抑制HuR基因的表达,可以有效抑制术后肠梗阻炎症反应程度并提高术后肠梗阻小肠肌肉收缩强度。4、HuR可成为预防和减轻术后肠梗阻的潜在的药物靶点。5、在P38/MK2的信号转导通路中,HuR可通过提高各种炎症因子mRNA的稳定性,参与术后肠梗阻的炎症反应的调节。