鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是水产养殖病害中常见的细菌病原，可感染鱼、虾、贝等多种水产动物，引起出血性败血症而导致养殖动物死亡，对养殖业造成重大经济损失。到目前为止，鳗弧菌的致病机制尚未完全阐明，在众多致病因子中，细菌的分泌系统可以将细菌细胞合成的各种毒素和酶作用于宿主组织或细胞，从而对宿主产生致病作用，因此分泌系统是病原菌致病作用的一个关键因子，对分泌系统的研究将有助于揭示鳗弧菌的正常生命活动过程，并为致病机制研究和弧菌病防治提供有价值的理论和基础。Ⅵ型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS）是2006年发现的一种新的细菌分泌系统，其作用机制尚未清楚。本实验室在之前的研究中，利用鳗弧菌M3菌株的Fosmid基因组文库，筛选获得了T6SS分泌系统基因簇的大部分序列。本研究在此基础上，利用Genome walking的方法，对鳗弧菌M3的T6SS上游启动子区进行了克隆；随后以鳗弧菌不同生长时期的cDNA为模板，利用T6SS基因簇的跨基因引物进行RT-PCR，对T6SS操纵子结构进行了分析；同时构建了T6SS基因簇共7个基因的框内缺失突变株，通过对基因缺失突变株的表型检测和转录水平检测，初步鉴定T6SS的功能；通过对T6SS跨膜蛋白的体外共表达和免疫共沉淀分析，初步确立了跨膜蛋白间的相互作用，为建立T6SS装配模型提供了实验证据；通过对T6SS分泌基质蛋白在不同条件下的检测，初步了解了鳗弧菌T6SS的分泌特性；本研究还构建了鳗弧菌σ⁵⁴因子和σ³⁸因子的基因缺失突变株，对其进行了表型检测和转录水平检测，初步鉴定了其功能；通过qRT-PCR技术，在转录水平分析了T6SS，σ⁵⁴因子和σ³⁸因子的调控关系，结合表型检测结果，初步构建了三者的调控关系网络。本研究取得的主要研究结果如下：1.克隆测序得到鳗弧菌T6SS上游大小为2584bp的DNA序列，生物信息学分析显示在T6SS上游有一个弱启动子；同时，在鳗弧菌的整个生长过程中，包括对数生长期和平台期，T6SS的基因簇vaa107-vaa121由一个共同的启动子起始转录，受同一个操纵子调控。2.通过基因框内缺失突变，构建了鳗弧菌vaa017、vaa109、vaa110、vaa115、vaa116、vaa117、vaa120共7个基因缺失突变株，表型检测显示，T6SS对鳗弧菌的正常培养条件下的生长没有显著性影响，但是对限铁条件下的生长、平板泳动能力以及菌膜生成能力都具有显著性的正调控作用；qRT-PCR检测显示T6SS对胞外金属蛋白酶EmpA和PrtV的表达具有正调控作用。3.生物信息学分析显示，T6SS蛋白VAA115和VAA120为跨膜蛋白；免疫共沉淀实验结果显示，脂蛋白VAA113与两个跨膜蛋白VAA115、VAA120均存在结构上的互作关系，说明VAA113与VAA115、VAA120三者协同对T6SS蛋白输送通道的装配起到重要作用。4.利用Western blot检测T6SS的分泌基质蛋白VAA017，结果显示鳗弧菌M3在不同培养条件下均无法检测到VAA017的存在，但是在另外的鳗弧菌菌株如L73中检测到了VAA017，这说明，不同鳗弧菌菌株的T6SS蛋白分泌情况差异比较大。5.构建了鳗弧菌σ因子RpoN(σ⁵⁴)和RpoS(σ³⁸)的基因框内缺失突变株和相应互补株，表型检测结果显示，RpoN和RpoS对鳗弧菌在限铁条件下的生长、泳动能力、菌膜形成、胞外多糖合成和分泌、胞外金属蛋白酶EmpA的表达分泌、明胶酶活性、毒力以及体内存活能力等有着显著性的正调控作用，其中RpoN还严格控制着鞭毛的生成；利用qRT-PCR对上述表型相关基因进行检测，结果显示与表型检测相一致。6.通过qRT-PCR结果，结合表型检测分析，初步构建了鳗弧菌T6SS，RpoN和RpoS的调控网络图。其中，T6SS对RpoN功能的发挥有增强作用，而RpoN对T6SS的基因簇以及基质蛋白表达均有正调控作用；RpoS对T6SS的表达也有正调控作用；同时发现，RpoN对RpoS为负调控，而RpoS可能对RpoN主要行使正调控作用。综合上述结果，本研究对鳗弧菌T6SS的功能，装配结构，分泌特性以及调控网络进行了研究，为将来进一步探究T6SS的作用机制奠定了重要的理论基础。