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为了研究河南华溪蟹卵子发生的细胞分子机制,本学位论文通过组织学观察,追踪了卵子发生和卵巢发育的过程,详细描述了卵子发生和卵巢发育的细胞学规律。在此基础上,结合前期获得的河南华溪蟹vasa生殖标记基因的序列,分析并揭示了vasa基因和蛋白的时空表达特征。研究主要包括三个部分:1.河南华溪蟹卵子发生和卵巢发育的组织学分析本文通过组织学和细胞学观察对河南华溪蟹卵子发生和卵巢发育的细胞学规律进行了研究。依据卵母细胞的形状和大小、卵黄颗粒的形成和积累及细胞核和细胞质,将卵子发生的过程分为四个时期,卵巢发育过程分为六个时期。卵子发生过程包括卵原细胞期、卵黄发生早期、卵黄发生期、成熟期,进一步分为六个时相,其中卵黄发生早期包括第一时相卵母细胞(OI)和第二时相卵母细胞(OII),卵黄发生期包括第三时相卵母细胞(OIII)、第四时相卵母细胞(OIV)和第五时相卵母细胞(OV),成熟期即第六时相卵母细胞(OVI)。卵巢发育过程包括增殖期、小生长期、大生长期、近成熟期、成熟期和恢复期,并且不同发育时期的卵巢的颜色和大小均存在显著差异。研究表明,卵母细胞的发育是不同步的,在不同发育时期的卵巢中同时存在两个或两个以上发育时相的卵母细胞。进一步统计和分析性腺指数可知卵巢的发育周期与季节密切相关,追踪发现河南华溪蟹的繁殖季节为每年5月至6月。2.河南华溪蟹VASA蛋白的原核表达、抗体制备及免疫鉴定本文选取河南华溪蟹vasa基因的特异区段,成功构建了原核表达载体pET32a-Shvasa。通过SDS-PAGE检测,完成了VASA融合蛋白的表达,获得了大量在菌液上清中约47 kDa的可溶性的VASA融合蛋白,制备了河南华溪蟹VASA蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测,表明河南华溪蟹VASA多克隆抗体的效价高达1:10~5。进一步进行免疫吸附和Western blot实验鉴定了抗体特异性,结果表明获得的多克隆抗体不仅识别VASA融合蛋白而且特异性识别河南华溪蟹卵巢中的天然VASA。3.河南华溪蟹vasa基因和蛋白在卵子发生过程中的表达模式本文通过SqRT-PCR检测了不同发育时期卵母细胞中vasa基因的表达。结果显示vasa在卵原细胞期和卵黄发生早期的表达量较高,在卵黄发生中期(OIV)vasa基因的表达量开始下降,并随着卵母细胞的发育成熟,vasa基因的表达量逐渐下降。通过Western Blot检测了VASA蛋白的组织分布,揭示了VASA蛋白在卵巢和精巢组织中特异表达。进一步通过荧光免疫组化方法,观察了不同发育时期的卵母细胞中VASA蛋白的动态分布。研究表明,在卵原细胞中VASA蛋白均匀分布于细胞质中,卵黄发生早期(OI和OII)VASA蛋白在细胞质中分布,同时逐渐向细胞核周围汇集,卵黄发生前期和中期(OIII和OIV)VASA蛋白主要分布在细胞核周围,卵黄发生中期(OIV)VASA蛋白的信号减弱。本文通过对河南华溪蟹卵子发生和卵巢发育的细胞学规律的研究,及对相关发育时期的划分和特征描述,为十足动物生殖生物学提供了数据资料。在此基础上,为进一步研究河南华溪蟹的生殖发育的分子机制,研究选用了生殖标记基因vasa,通过对VASA蛋白特异性多克隆抗体的制备及其表达特征的研究,为鉴定河南华溪蟹及其他蟹类的生殖细胞提供了有效手段,对进一步解析十足动物VASA蛋白的功能和卵子发生的调控机制提供了分子基础。