研究背景和目的自噬是细胞内组分包括蛋白质、脂质、糖类、核苷酸、细胞器及入侵的病原体被运送到溶酶体降解的过程。降解产物可以被细胞重新用于营养循环或细胞器更新,因此自噬对于维持细胞内稳态和能量代谢平衡非常重要。自噬可被多种因素诱导,例如营养或生长因子缺乏、低氧、活性氧、DNA损伤、受损细胞器及病原体入侵等,此时,自噬主要起保护性的作用使机体适应环境变化。自噬失调会导致重大疾病发生,包括心血管疾病、神经退行性病变、肿瘤、动脉粥样硬化和老化等。因此,研究自噬的分子机制具有极为重要的病理、生理学意义。血管内皮细胞是覆盖于血管内膜表面的单层细胞,在保护内膜完整性及维持血液流动和稳态方面起着关键的作用。内皮功能的失调会引发多种疾病如高血压、动脉硬化、高血糖症等。自噬和血管内皮功能的失调都会导致疾病。因此,近年来自噬的功能以及自噬对正常内皮细胞功能的调节成为研究热点。在前期研究中,我们发现化学小分子ABO可以诱导正常培养条件下血管内皮细胞自噬,并可以抑制去血清去生长因子诱导的内皮细胞凋亡。进一步研究发现膜联蛋白A7(ANXA7, Annexin A7, synexin)通过对钙离子的调控在ABO诱导的内皮细胞自噬中发挥关键的作用。ANXA7是钙离子依赖的磷脂结合蛋白-Annexins家族成员之一,具有形成钙离子通道及调节胞内钙离子稳态的功能。并且我们的前期数据表明ANXA7介导的细胞自噬信号通路与经典的mTOR、ROS介导的信号通路不同,表明ANXA7介导着新的细胞自噬信号通路,但是其下游因子尚未知。ANXA7在诱导血管内皮细胞自噬中发挥重要的作用,然而其调节内皮细胞的自噬机理尚不清楚。为此,本研究利用酵母双杂交系统筛选和鉴定了与ANXA7相互作用的蛋白,并研究其相互作用与调节血管内皮细胞自噬之间的关系,这为阐明血管内皮细胞自噬的分子机制提供实验证据。具有调节细胞或蛋白功能及生物学过程的化学小分子是研究细胞信号通路和疾病机理的良好工具,同时可为开发治疗相关疾病的药物奠定基础。另外,细胞自噬和凋亡之间关联密切,但是其关联机制仍未知。因此,本研究第二部分内容为筛选和鉴定能够调节肺癌细胞自噬与凋亡的化学小分子,目的是为深入研究肺癌细胞自噬和凋亡及其关联的复杂机理提供新的工具和切入点,同时为开发新的治疗肺癌的药物提供新先导化合物。研究内容1.利用酵母双杂交系统筛选并鉴定与ANXA7相互作用的蛋白(1)构建诱饵蛋白表达载体NpGBKT7-ANXA7(2)检测诱饵蛋白对酵母细胞AH109的毒性及自激活效应(3)筛选人肝脏cDNA文库(4)生物信息学分析阳性文库质粒,并在血管内皮细胞内验证候选蛋白与ANXA7的相互作用2.筛选出与ANXA7相互作用的粒钙蛋白,并研究其在化学小分子ABO诱导血管内皮细胞自噬中的调控作用。(1)ABO对粒钙蛋白和ANXA7相互作用的影响(2)ABO对粒钙蛋白在血管内皮细胞分布的影响(3)抑制粒钙蛋白的表达对ABO诱导的血管内皮细胞自噬的影响(4)粒钙蛋白和ANXA7的相互作用对血管内皮细胞钙离子的影响3.利用肺癌细胞筛选能够诱导细胞自噬与凋亡的化学小分子,为研究自噬或凋亡的细胞信号通路提供工具,为开发相关治疗疾病的药物奠定基础。(1)小分子化合物对P53野生型A549细胞生长及作用机制研究(2)小分子化合物对P53突变型H322细胞生长及作用机制研究(3)小分子化合物对P53缺失型H1299细胞生长及作用机制研究(4)小分子化合物对正常胚肺细胞生长作用的影响研究方法Ⅰ.利用酵母双杂交系统筛选鉴定与ANXA7相互作用的蛋白并研究其在血管内皮细胞自噬中的作用1.诱饵表达载体NpGBKT7-ANXA7构建：以pCMV6-XL5-ANXA7质粒为扩增ANXA7基因序列的模板,使用引物/ANXA7-F/R引入特异性的酶切位点。PCR产物双酶切后连接入酵母表达载体NpGBKT7中。2.检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性和自激活效应：根据Clontech公司操作手册,将诱饵质粒NpGBKT7-ANXA7和空载体NpGBKT7分别转入酵母感受态细胞AH109,根据转化两种质粒的酵母在固体SD/-Trp缺陷培养基的生长表型,以及在液体SD/-Trp缺陷培养基中的菌体密度判断诱饵蛋白对酵母细胞的毒性。将NpGBKT7-ANXA7和pGADT7快速共转入酵母AH109,通过酵母在不同3-AT浓度的SD/-Trp/-Leu/-His平板上的长势判断诱饵蛋白有无自激活效应。3.筛选cDNA文库：根据操作手册将人肝脏cDNA文库转化携带诱饵质粒的酵母感受态细胞,取100μl梯度稀释的细胞悬液,分别涂布于φ9cm SD/-Trp/-Leu板上计算转化效率,剩余酵母菌液涂在含2.5mM3-AT的SD-Trp/-Leu/-His φ15cm平皿内初步筛选阳性克隆。4.Cos7细胞培养与转染:Cos7细胞培养于含10%胎牛血清、100Units/ml青霉素和100mg/ml链霉素DMEM培养基中。细胞转染按照Invitrogen公司转染试剂LipofectamineTM2000的使用手册操作。5.候选蛋白与ANXA7相互作用的鉴定：免疫共沉淀和免疫荧光共定位方法检测。6.血管内皮细胞的分离与培养：参考Jaffe等的方法(Jaffe et al.,1973)。7.细胞内蛋白表达水平及分布检测：免疫细胞化学染色法结合激光扫描共聚焦显微镜检测粒钙蛋白的分布。Western blot方法检测粒钙蛋白表达水平。8.利用RNA干扰技术降低HUVEC粒钙蛋白表达水平：HUVEC细胞长至80-90%时,利用QIAGEN公司的转染试剂将scramble RNA和靶向粒钙蛋白的siRNA转入细胞,western blot方法检测干扰效果。9.细胞内游离钙离子浓度检测：利用高度特异性钙离子荧光探针Fluo-3AM结合激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+水平变化。Ⅱ.肺腺癌细胞生长抑制、自噬和凋亡诱导剂的筛选及其作用机制研究1.倒置相差显微镜观察细胞形态2.SRB方法检测细胞存活率3.LDH(乳酸脱氢酶)法检测细胞是否坏死4.吖啶橙(AO)染色以及Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平检测细胞是否发生自噬5. Hoechst染色检测细胞是否发生凋亡研究结果Ⅰ.利用酵母双杂交系统筛选和鉴定与ANXA7相互作用的蛋白并研究其在血管内皮细胞自噬中的作用1.利用酵母双杂交系统筛选到四种与ANXA7相互作用的蛋白,分别为：粒钙蛋白、T细胞抗原毒性颗粒相关RNA结合蛋白、补体因子H及纤维蛋白原p链相互作用。1.1诱饵表达载体构建：ANXA7的开放阅读框由1467个核苷酸序列组成,重组载体NpGBKT7-ANXA7经菌落PCR(图Ⅰ-1-2)和限制性内切酶Sal Ⅰ和NotⅠ双酶切(图Ⅰ-1-3)均能在1500bp处检测到条带,说明目的基因已连入载体中。测序结果没有碱基突变,进一步表明载体构建正确。1.2诱饵蛋白毒性和自激活检测：携带诱饵质粒NpGBKT7-ANXA7和空载体NpGBKT7质粒的AH109在固体SD/-Trp缺陷培养基的均生长良好,长出的单克隆克隆数目和大小大致相近(图Ⅰ-1-5)；在液体SD/-Trp缺陷培养基中过夜培养后,600nm的吸光度分别为1.51和1.54,表明诱饵蛋白对酵母细胞没有毒性,不影响酵母的正常生长。自激活检测确定了筛选文库的最低3-AT浓度为2.5mM(图Ⅰ-1-6)。1.3cDNA文库筛选：将人肝朋cDNA文库转入携带诱饵质粒NpGBKT7-ANXA7的酵母中共产生1.72×106个转化子(图Ⅰ-2-1),经第一轮筛选长出2000多个克隆(图Ⅰ-2-2)。选取直径>2mm得200个克隆分别利用HIS, ADE和LacZ三个报告基因进行选择(图Ⅰ-2-3,Ⅰ-2-4,Ⅰ-2-5)。根据三轮筛选结果选取62个阳性克隆的文库质粒扩增后进行Xho I和]EcoR I双酶切验证,酶切片段长于500bp的质粒送交公司测序。1.4生物信息学分析：测序结果利用NCBI在线工具分析,去除公认的假阳性克隆和重复克隆,共得到编码四种蛋白的基因序列,分别是：粒钙蛋白、T细胞抗原毒性颗粒相关RNA结合蛋白、纤维蛋白原β链和补体因子H(表一)。2. ANXA7在细胞内与粒钙蛋白、T细胞抗原毒性颗粒相关RNA结合蛋白和纤维蛋白原p链发生相互作用2.1分别构建携带GFP和Myc标签的pEGFP-ANAX7, pEGFP-GCA, pEGFP-TIA-1, pEGFP-FGB和pEGFP-CFH(图Ⅰ-3-1)和pMyc-ANAX7, pMyc-GCA. pMyc-TIA-1, pMyc-FGB和pMyc-CFH(图Ⅰ-3-2)经双酶切验证及测序证实载体构建成功。将10种重组质粒分别转染Cos7细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察(图Ⅰ-3-3)和、western blot检测结果显示融合蛋白的表达(图Ⅰ-3-4,Ⅰ-3-5)2.2将pEGFP-ANAX7与pMyc-GCA, pMyc-TIA-1, pMyc-CFH, pMyc-FGB共同转染Cos7细胞,pMyc-C2作为空白对照。48h后裂解细胞,细胞裂解液以anti-Myc小鼠单克隆抗体进行免疫沉淀实验,western blot结果发现带有Myc标签的四种文库质粒编码蛋白均能将A7沉淀下来,而空白对照不能,说明四种蛋白和ANXA7存在相互作用(图Ⅰ-3-6)。反向免疫共沉淀再次验证ANXA7和TIA-1与FGB具有相互作用(图Ⅰ-3-7)。2.3利用GCA, TIA-1, CFH, FGB的抗体在血管内皮细胞内进行免疫共沉淀实验,结果发现与GCA、TIA-1和FGB抗体孵育的细胞裂解液内能检测到ANXA7,而CFH抗体则不能,说明在血管内皮细胞内ANXA7可以和GCA,TIA-1, FGB发生相互作用,不能和CFH发生相作用(图Ⅰ-3-8)。3.GCA在ABO诱导的血管内皮自噬中发挥关键作用3.1ABO增强血管内皮细胞ANXA7和GCA的相互作用：分别用50μM R-ABO和S-ABO处理血管内皮细胞6h、12h和24h,取等蛋白量的细胞裂解液以GCA抗体进行免疫沉淀实验, western blot检测结果发现R-ABO和S-ABO处理细胞12h和24h后,ANXA7的蛋白量显著增多,说明ANXA7和GCA的相互作用均显著增强(图Ⅰ-4-2A,B)。同样在未经化合物处理的细胞提取液内分别加入R-ABO, S-ABO和ABO(混合型),随后与GCA抗体4℃孵育过夜,western blot检测ANXA7,结果再次表明R-ABO, S-ABO和ABO可以增强ANXA7和GCA的相互作用(图Ⅰ-4-2C,D)。3.2ABO调节血管内皮细胞粒钙蛋白的分布：以50μM ABO, R-ABO和S-ABO处理血管内皮细胞24h,免疫细胞化学染色的方法检测粒钙蛋白的分布,结果发现ABO处理的血管内皮细胞中GCA的分布出现点状簇集现象(图Ⅰ-4-3)。3.3RNA干扰下调粒钙蛋白的表达水平：以20nM和40nM特异阻断粒钙蛋白表达的siRNA处理细胞24h和48h,利用western blot方法检测干扰效果。结果表明20nM和40nM粒钙蛋白的siRNA,24h和48h时均能有效抑制粒钙蛋白的表达,其中40nM效果较为显著(图Ⅰ-4-4)。3.4粒钙蛋白参与ABO诱导的血管内皮细胞自噬：以40nM粒钙蛋白siRNA和scrambled RNA处理细胞24h后,再利用ABO继续处理24h。免疫荧光染色结果显示与对照组相比LC3-Ⅱ的点状分布显著减少(图1-4-5A, B). Westem blot检测结果显示LC3-Ⅱ蛋白积累显著减少(图Ⅰ-4-5C.D)。说明在ABO诱导的血管内皮细胞自噬中粒钙蛋白发挥关键作用。3.5干扰GCA不影响ANXA7的蛋白表达：以40nM粒钙蛋白siRNA和scrambledRNA处理细胞24h后,再利用ABO继续处理24h。Western blot检测结果显示未用ABO处理组ANXA7没有显著变化,而处理组ANXA7蛋白水平显著上升(与前期已发表数据一致),说明GCA不影响ANXA7的蛋白表达(图Ⅰ-4-6)。3.6利用RNA干扰技术抑制粒钙蛋白表达引起细胞内游离Ca2+浓度上升：利用siGCA下调粒钙蛋白的表达,加入钙离子荧光探针检测,结果显示游离Ca2+浓度显著上升。说明粒钙蛋白参与了对细胞内游离Ca2+的调控(图Ⅰ-4-7)。Ⅱ.肺腺癌细胞生长抑制、自噬和凋亡诱导剂的筛选及其作用机制研究1.12种吡唑酰胺衍生物(3a-31)对A549细胞生物活性的影响1.13a-31(结构式图Ⅱ-1)不影响A549细胞的形态：分别用8μM、16μM、32μM和64μM的处理A549细胞24h和48h,与对照组相比,化合处理组的细胞形态物无显著变化,3e-3h在高浓度处理48h细胞数量有明显减少,其它8种化合物无论细胞数量还是细胞形态都未发现明显变化(图II-2A,II-2B)。1.23e-3h抑制A549细胞增殖：SRB检测结果表明3e-3h能不同程度的抑制A549细胞的生长,其中32μM和64gM有较好的抑制效果,抑制率在20%-50%(图Ⅱ-3)。1.33e-3h引起细胞中酸性膜泡增多：用32μM和64μM的3e-3h处理A549细胞24h和48h,吖啶橙染色结果显示与对照组相比,32μM和64μM的3e-3h能够使细胞内的酸性膜泡明显增多,其中64μM处理48h效果更显著(图Ⅱ-4)。说明上述化合物可能诱导了A549细胞自噬。为进一步证实是否发生自噬,我们检测了利用western blot方法检测了自噬的标志性蛋白LC3-Ⅱ的积累和p62的降解,结果显示与对照组相比LC3-Ⅱ和p62蛋白水平并无显著性变化,说明四种化合物不是通过诱导自噬抑制A549细胞增殖(图Ⅱ-5)。1.43e-3h不引起细胞坏死：用64μM的3e-3h处理A549细胞48h,测定上清中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)的活性,结果显示与对照组相比,处理组LDH活性无显著上升,表明3e-3h不引起A549细胞坏死(图Ⅱ-6)。1.53e-3h不诱导细胞凋亡：Hoechst染色显示化合物的处理细胞核均末出现凝集破碎或趋边等凋亡特征,说明3e-3h不引起A549细胞凋亡(图Ⅱ-7)。1.63e-3h阻滞细胞周期：流式细胞术检测3e-3h对A549细胞细胞周期分布的影响,结果显示四中化合物均能够有效的将A549细胞周期阻滞在G1期(图Ⅱ-8)。2.3e-3h对H322和H1299细胞生物活性的影响2.1利用16μM、32μM和64μM的3e-3h处理H322细胞和H1299细胞24h和48h,形态学观察发现两种细胞均表现出体积缩小,细胞膜边缘凸起等凋亡特征(图Ⅱ-9A,B；Ⅱ-10A,B)2.2SRB检测结果显示32μM和64gM的3e-3h处理的细胞存活率明显下降(图Ⅰ-9C,Ⅰ-10C)2.3Hoechst33258染色结果显示,与对照组相比,化合物处理的细胞核明显表现出收缩、凝集且被染为亮蓝色等凋亡细胞的特征,说明细胞确实发生了凋亡(图Ⅰ-9D,E；Ⅰ-10D,E)。3.3e-3h对正常胚肺细胞的影响我们进一步研究了上述四种化合物对人正常胚肺细胞的影响,以32μM和64gM处理细胞48h, SRB检测结果表明细胞的生长基本不受影响,只有3e和3f在32μM有稍许促进增殖的作用(图Ⅱ-11)。结论Ⅰ.本研究利用酵母双杂交系统筛选到四种和ANXA7相互作用的蛋白,这四种蛋白与ANXA7的关系尚未有报道。1.成功构建了酵母双杂交诱饵载体NpGBKT7-ANXA7,并经测序证实正确,为筛库创造了条件。2.将重组诱饵质粒NpGBKT7-ANXA7转化酵母菌株AH109,检测表达的融合蛋白对宿主菌无毒性和自激活作用,可进一步用于筛选cDNA文库。3.通过筛选成人肝脏cDNA文库,经四轮筛选逐步排除假阳性克隆,得到了62个阳性克隆,并经测序及生物信息学分析后确定4个候选蛋白：粒钙蛋白,T细胞抗原毒性颗粒相关RNA结合蛋白,纤维蛋白原β链和补体因子H。4.免疫共沉淀实验证实粒钙蛋白,T细胞抗原毒性颗粒相关RNA结合蛋白和纤维蛋白原β链与ANXA7在血管内皮细胞内发生相互作用。5.粒钙蛋白是EF手家族的钙离子结合蛋白,其生物学功能尚不清楚。本研究首次发现粒钙蛋白是ABO诱导的血管内皮细胞自噬的关键蛋白。ABO能增强粒钙蛋白和ANXA7的相互作用,抑制粒钙蛋白的表达ABO不能诱导血管内皮细胞自噬,并且细胞内游离钙离子浓度显著增加。Ⅱ.本部分我们筛选了12种吡唑酰胺化合物,有四种即3e-3h在高浓度时可以抑制A549细胞、H322和H1299细胞增殖。它们发挥作用是通过阻滞A549细胞细胞周期,诱导H322和H1299细胞凋亡。