谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13,Transglutaminase),是一类催化蛋白质分子间或分子内发生酰基转移的一类转移酶,来源广泛,存在于动物、植物以及微生物中,其中微生物来源的酶,即微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,MTG)具有分子量小、钙不依赖、底物特异性及生产周期短等优势,被广泛用于食品、医药、纺织业等工业化生产当中。目前,工业化生产中,茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)被作为主要的发酵产酶菌种。野生的茂源链霉菌在生产过程中会出现产MTG量较低、生产成本较高等问题,从而无法应用于大规模工业化生产。为解决这一问题,实验人员对野生菌株进行传统诱变育种及基因工程等手段,以期获得了高产的菌株,大幅度提高了 MTG的产量,然而传统的诱变工作量大,负突变较多,使得筛选工作繁重且效率低。此外,在外源宿主中,MTG产量的相较于原始茂源链霉菌而言,提高了很少,且由基因工程改造得到的酶,不能用于食品等领域,加之基因工程手段复杂精细,因此,无法实现工业化生产。综上所述,对传统诱变得到的高产菌株产MTG的高产机制的研究十分重要。本文从蛋白水平、基因组水平以及转录水平,分别对出发菌株TX1和高产菌株sm2-1进行对比研究,比较两株菌产MTG在胞内胞外蛋白分泌量、基因序列以及转录水平的差异,探究这些差异对菌株代谢通路的影响,从而分析出可能的高产机制。结果如下:(1)高产菌株和出发菌株基因组水平的差异。首先对高产菌株和出发菌株进行基因组重测序,使用生物信息学方法对基因组进行分析、预测及注释等。可知,在高产菌株和出发菌株中pre-pro-MTG基因序列一致,编码与酶成熟有关的蛋白等调控因子如TAMEP、SM-TAP等的基因序列也完全一致。因此,酶产量的提高与酶本身的基因序列及酶成熟过程无关。然而,对两株菌进行SNV(single nucleotide variant)的分析可知,在编码区和非编码区分别有数十个点突变发生,其中在MTG的非编码区有一个点突变,且对该非编码区进行启动子的预测可知,此突变位点位于启动子区域。其他点突变分别位于与C代谢、氨基酸合成与代谢、细胞壁形成以及蛋白跨膜运输等代谢通路有关的酶、蛋白的基因序列或非编码区中,可能间接影响MTG的合成和分泌。(2)高产菌株和出发菌株中谷氨酰胺转氨酶在胞内产量的比较。郭玮婷等研究者已证明,该酶分泌到胞外时,高产菌株产酶量(pro-MTG)已显著高于出发菌株。而谷氨酰胺转氨酶在胞内以pre-pro-MTG形式存在,分别同时选取两株菌24h、44h以及50h的发酵液,提取各菌体裂解的胞内物质进行Western Blot。结果表明,高产菌株pre-pro-MTG转运速率较快,前体酶一经产生就转出胞外;出发菌株转运速率较慢,一部分前体酶在胞内切割成成熟的MTG。(3)对两株菌MTG转录水平的分析可知,以16sRNA为参照,高产菌株MTG的相对表达量约为6.9左右,而出发菌株的相对表达量约为0.1左右,高产菌株相较于出发菌株相对表达量提高约60至70倍,p-value值<0.0001,即相对表达量有显著差异,证明两株菌中MTG在RNA水平上有显著差异,高产菌株显著高于出发菌株。(4)结合基因组水平和转录水平的差异,使用大肠杆菌质粒pSET152作为载体、绿色荧光蛋白作为报告基因,对MTG非编码区的点突变与MTG转录水平的相对表达量改变的关系进行分析研究,验证了以16sRNA为内参基因时,该高产菌株接合子绿色荧光蛋白转录水平相对表达量约138,,出发菌株接合子绿色荧光蛋白转录水平相对表达量约51,高产菌株接合子较出发菌株接合子提高约一倍多,p-value值为0.0021,差异显著,说明该点突变对绿色荧光蛋白的转录水平相对表达量产生了显著影响。因此,高产菌株非编码区相较于出发菌株发生的点突变,是导致pre-pro-MTG转录水平相对表达量提高的原因。本实验室保存的茂源链霉菌产MTG的产量提高由于MTG上游非编码区突变使得MTG在转录水平上相对表达量显著提高,从而使得MTG蛋白表达量增加,产酶增加。