Y连锁DEAD解旋酶因子(DEAD-box helicase 3 Y-linked,DDX3Y),属于ATP依赖性RNA解螺旋酶,参与RNA代谢、核糖体合成、转录调控、细胞周期调控等过程。DDX3Y位于Y染色体上,属于雄性特异性基因,在精子发生中发挥重要调控作用。然而,对DDX3Y的研究主要集中在人和小鼠上,在山羊上鲜见报道。抗体是研究基因功能的重要工具,获得奶山羊特异性DDX3Y蛋白抗体对研究DDX3Y基因在奶山羊精子发生中的功能机制至关重要。本研究克隆得到了奶山羊DDX3Y基因的CDS区全序列,生物信息学分析筛选出了适合作为抗原的蛋白区段。在原核系统中诱导表达出了奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白。用Ni-NTA Resin亲和纯化后的抗原免疫3月龄雌性新西兰大耳兔,制备出高效价的奶山羊特异性DDX3Y蛋白多克隆抗体,为DDX3Y在奶山羊精子发生过程中的功能研究提供了基础材料。本研究的主要结果如下:1. PCR得到奶山羊DDX3Y基因的完整CDS区,测序得到DDX3Y基因CDS全序列。DDX3Y CDS区全长1 983 bp,编码660个氨基酸。生物信息学分析发现DDX3Y蛋白N端1-120氨基酸、C端570-660氨基酸适合作为抗原进行原核表达。PCR得到这2段抗原片段的基因序列,分别为DDX3Y CDS区5’端360 bp(1-360 bp)和CDS区3’端273 bp(1 710-1 983 bp)。搭桥PCR连接2段抗原编码基因得到DDX3Y 633 bp的截短抗原蛋白基因序列。2. 构建了p ET32a(+)-DDX3Y原核表达载体,表达出分子质量为23 ku的DDX3Y截短抗原蛋白。用Ni-NTA Resin对DDX3Y截短抗原蛋白进行亲和纯化,SDS-PAGE检测纯化效果良好,蛋白质量浓度≥2.5 mg/m L。3. 用获得的DDX3Y截短抗原蛋白免疫新西兰大耳兔,制备了奶山羊特异性DDX3Y蛋白多克隆抗体。I-ELISA检测抗体效价达到1:10~5。Western blot检测表明制备的DDX3Y蛋白多克隆抗体特异性良好,可作为奶山羊DDX3Y基因功能研究的分子工具。对奶山羊成熟精子及精原干细胞蛋白样品的Western blot检测显示,奶山羊成熟精子不表达DDX3Y蛋白,而精原干细胞中明显表达。综上所述,本试验成功表达并纯化得到奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白,制备出高效价的奶山羊特异性DDX3Y蛋白多克隆抗体,为后续DDX3Y在奶山羊精子发生过程中调控机理的研究提供了重要的试验材料。