目的：通过培养新生兔原代肝细胞，并建立肠外营养相关性肝病(Parenteralnutrition-associatedliverdisease，PNALD)细胞模型——肝细胞脂肪变模型，研究内质网应激（Endoplasmicreticulumstress，ERS）相关标志蛋白——糖调节蛋白94（GRP94）在新生兔肝细胞的表达变化，探讨GRP94在PNALD发病机制中的作用，并试图在细胞水平揭示鱼油改善PNALD可能的作用机制，为临床预防和治疗PNALD提供新的思路和实验依据。材料与方法:母乳喂养7日的新西兰新生兔8只，雌雄不限，饲养于恒温暖箱，温度维持在26～28℃之间，相对湿度40%～60%，全麻下剖腹取肝脏组织，采取I型胶原酶消化法获取肝细胞，并行传代、培养。将原代肝细胞随机分五组（组1、组2、组3、组4、组5），分别以DMEM培养液，0.2%、0.4%、1%、2%的脂肪乳培养肝细胞。在不同的时间点(24h、48h、72h、96h)分别对各组细胞进行油红O染色观察细胞脂肪变情况，同时行MTT法检测细胞活性，以确定建PNALD细胞模型的脂肪乳最适浓度。另将原代肝细胞随机分成对照组（CON组）、1%鱼油组（A组）、0.4%鱼油组（B组）、1%脂肪乳组（C组）和0.4%脂肪乳组（D组）五组，CON组用DMEM培养液培养，A组用1%-3鱼油脂肪乳培养，B组用0.4%-3鱼油脂肪乳培养，C组用1%脂肪乳培养，D组用0.4%脂肪乳培养。在不同的时间点(24h、48h、72h，96h)分别收集五组细胞通过油红O染色及电镜观察肝细胞脂肪变情况；MTT法检测细胞活性；全自动生化仪检测各时间点（0h、24h、48h、72h）细胞培养液生化指标变化；采用半定量逆转录多聚酶链式反应法（RT-PCR）检测肝细胞ERS相关标识蛋白—GRP94mRNA的表达；采用免疫组织化学技术检测肝细胞GRP94蛋白表达。结果：1.原代肝细胞培养：实验共获得肝细胞8.82×105个，台盼蓝染色细胞活率为92.11%。培养4h后细胞开始贴壁，24h后可见90%以上肝细胞已贴壁，8~10d细胞连接成单层。PAS染色后，低倍镜下可见肝细胞有大量红染的糖原颗粒，高倍镜可见下细胞质内密集粉红色糖原颗粒。2.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定：五组肝细胞4个时间点（24h、48h、72h、96h）五组肝细胞MTT OD值比较均有统计学意义（P﹤0.01）。与组1相比，组5在4个时间点OD值均明显降低，差异有统计学意义（P﹤0.01）；组4仅在96h细胞OD值较组1下降明显（P﹤0.01），其余3个时间点无明显改变（均P﹥0.05）；组2和组3在4个时间点细胞OD值均无明显下降（P﹥0.05）。3.造模后各组肝细胞形态、活力、超微结构变化：五组肝细胞在培养24h、48h和72h三个时间点MTT OD值无明显改变，差异无统计学意义（P﹥0.05），96h细胞OD值在五组之间比较，差异有统计学意义（P﹤0.01），且C组较CON、A组、B组和D组均明显下降（P﹤0.01）；五组间肝细胞形态、超微结构比较，CON组四个时间点细胞形态正常，细胞间结合紧密，结构完整，A组在24h开始出现少量脂肪变细胞，72h细胞轮廓发生改变、随着时间的延长脂肪变细胞增加，超微结构可见内质网轻微扩张，线粒体数量减少，其内嵴仍较多。B组仅96h出现少量脂肪变细胞，细胞形态、超微结构均未见明显改变。C组24h即可见大量脂肪变细胞，且随着时间的延长，脂肪变细胞增多、程度加重，内质网扩张明显，线粒体呈空泡改变，其内嵴明显减少。D组24h开始出现少量脂肪变细胞，亦随时间延长而增加，超微结构可见内质网轻微扩张，线粒体数量减少，其内嵴未见明显减少。4.细胞培养液生化指标：三个时间点（24h、48h、72h）培养液生化指标中TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH、ALB在五组间比较，差异均有统计学意义（P<0.01），而TP、TG、PA水平在五组间无显著性差异（P0.05）。C组在三个时间点TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH均较CON、A、B和D组明显升高（P<0.01），而ALB均明显降低（P<0.01）；CON、A、B和D组TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH水平两两之间比较均无明显改变（均P>0.05）。CON、A、B和D组组内比较四个时间点（0h、24h、48h、72h）生化指标中TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH、ALB、TP、TG、PA水平均无显著差异（P0.05），而C组TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH和ALB均有显著性差异（P<0.01），TP、TG、PA水平则无明显改变（P0.05），且随着时间的延长，TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH有显著增高的趋势（P<0.01），ALB则有明显下降的趋势（P<0.01）；与0h比较，24h、48h和72h TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH明显增高（P〈0.01），ALB明显下降（P<0.01）；与24h比较，48h和72h TBIL、DBIL、ALT、AST、γ-GT、LDH明显增高（P<0.01），ALB明显下降（P<0.01）；与48h比较，72h培养液生化指标结果得出相同结果。5. ERS相关标志蛋白GRP94mRNA表达：RT-PCR结果显示，三个时间点（24h、48h、72h）五组肝细胞间GRP94mRNA表达均有显著差异，有统计学意义（P<0.01）。C组肝细胞GRP94mRNA表达较CON、A、B和D组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。CON、A、B和D组之间两两比较均无明显改变（P>0.05）。CON、A、B和D组四组组内比较三个时间点GRP94mRNA表达均无显著差异（P0.05）。而C组内各时间点均有显著性差异（P<0.01），与24h相比，48h和72h细胞GRP94mRNA表达明显升高（P <0.01）；与48h数值相比，72h细胞GRP94mRNA表达亦明显升高（P <0.01）。6．ERS相关标志蛋白GRP94蛋白表达：免疫组织化学结果显示，三个时间点（24h、48h、72h）五组肝细胞间GRP94蛋白表达灰度值均有显著差异，有统计学意义（P<0.01）。C组肝细胞GRP94蛋白表达灰度值较CON、A、B和D组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。CON、A、B和D组之间两两比较均无明显改变（P>0.05）。CON、A、B和D组四组组内比较三个时间点GRP94蛋白表达灰度值均无显著差异（P0.05）。而C组内各时间点均有显著性差异（P<0.01），与24h相比，48h和72h细胞GRP94蛋白表达灰度值明显升高（P <0.01）；与48h数值相比，72h细胞GRP94蛋白表达灰度值亦明显升高（P <0.01）。结论：1.本实验成功培养了新生兔原代肝细胞；2.本实验通过不同浓度脂肪乳培养肝细胞，筛选出实验造模的最适脂肪乳浓度，为进一步开展细胞实验研究奠定基础；3.本实验成功建立了新生兔肠外营养相关性肝病细胞模型——肝细胞脂肪变模型，为进一步研究其发病机制奠定了基础;4.1%脂肪乳组肝细胞GRP94mRNA和蛋白表达水平均较CON组有显著升高，组内各时间点比较表达呈明显上升趋势，而0.4%脂肪乳组肝细胞则表达无显著变化，提示ERS与PNALD的发生和发展直接相关，且脂肪乳浓度、作用时间与PNALD的发生、发展密切相关；5.-3鱼油脂肪乳组（A组、B组）肝细胞GRP94mRNA和蛋白表达均较1%脂肪乳组明显降低，而与CON组无差异，提示-3鱼油脂肪乳能预防PNALD发生，并可能是通过抑制肝细胞中ERS相关蛋白——GRP94的表达而起作用。