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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种世界上应用广泛的生防微生物,它具有高度的杀虫特异性和对人畜无害的优点。主要的杀虫成份是杀虫晶体蛋白,其由cry和cyt基因编码。其中cry9类基因的表达产物对鳞翅目多种害虫具有较高的杀虫活性,但是由于检测方法的局限性,发现的基因种类不多,活性高的基因更少。为了充分发掘Bt菌株中cry9类基因资源,本研究建立了一种基于PCR产物,利用高分辨熔解曲线(high resolution melting HRM)进行cry9类基因分型的方法。根据所有已报道的cry9类基因的保守区设计一对扩增片段为100 bp的通用鉴定引物,利用高分辨熔点仪对产物的熔解曲线进行分析,由于扩增产物的碱基组成不同,不同类型的基因产生不同的熔解曲线,从而将样品进行基因分类。该方法可以高通量地进行基因分型,特别是可以检测出已知及新型的cry9类基因。本研究利用PCR方法鉴定菌株SC5-D2和SC5-E8中分别含有cry9Aa和cry9Ea基因,以上述两个cry9类基因作为标准样品对该方法进行了验证。应用建立的HRM平台对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株进行cry9类基因型的鉴定,PCR阳性的有3株。根据熔解曲线发现B.thuringiensis subsp.fukuokaensis(T03C001)含有cry9Aa基因片段,B.thuringiensis subsp.sumiyoshiensis(T03B001)含有cry9Da和两个新型cry9类基因片段,B.thuringiensis subsp.japonensis(T23001)含有cry9Da基因片段。以上述cry9基因片段为标准样品应用HRM平台对2000株分离株进行cry9类基因型的鉴定,PCR阳性的有273株,熔解曲线类型为20类,经测序分析其中菌株SC5-D4菌株中含有cry9Ba基因。根据这些基因的全长序列设计扩增cry9类基因的全长引物,成功克隆上述基因,并被国际Bt命名委员会正式命名为cry9Aa3,cry9Ea8,cry9Aa4,cry9Da3,cry9Da4,cry9Eb2, cry9Ee1,cry9Ba3。利用表达载体pEB在大肠杆菌Rosetta(DE3)对这些基因进行表达,表达产物均为130 kDa左右的蛋白(Cry9Ba3未表达)。Cry9Aa3,Cry9Aa4,Cry9Eb2,Cry9Ee1对鳞翅目害虫小菜蛾杀虫活性较高,LC50分别为1.83μg/mL.1.90μg/mL.1.03μg/mL和1.70μg/mL;且上述四个蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾毒力较高,LC50分别为1.39μg/mL、1.74μg/mL.1.24μg/mL和1.45μg/mL。表明四种Cry9蛋白在小菜蛾的毒力上与CrylAc都没有交互抗性。而Cry9Ea8,Cry9Da3,Cry9Da4对小菜蛾无活性。Cry9Aa3,Cry9Aa4,Cry9Eb2, Cry9Ee1对另一种鳞翅目害虫亚洲玉米螟杀虫活性较好,LC50分别为6.93μg/mL、1.06μg/mL、5.93μg/mL和2.20μg/mL,对棉铃虫有一定的体重抑制。而Cry9Ea8, Cry9Da3, Cry9Da4对小菜蛾和亚洲玉米螟均无活性。上述已表达的七种Cry9蛋白对大猿叶甲和小地老虎两种害虫均无活性。