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肾母细胞瘤(Nephroblastoma),又称Wilm’s瘤,起源于胚胎性组织,是儿童最常见的腹部恶性肿瘤之一,多发生于5岁以下儿童,中国的发病率约为3.3每百万人,其发病率约占儿童恶性肿瘤的8-10%和儿童肾脏肿瘤95%。近年来,由于综合治疗措施的进步,使得疾病的生存率有了很大提高,目前国际上总生存率可达到70%至80%,甚至更高。但在疾病的末期仍有恶性转移的可能性,目前该病仍有5%的死亡率。因此,发现肾母细胞瘤发生发展的分子机制,对找到干预肿瘤发生,发展的方法和提高肿瘤的治愈率有重要意义。microRNAs(miRNAs)是一类长约17-24个核苷酸的内源性单链非编码RNA,通过与靶mRNA完全或不完全互补配对,导致靶mRNA降解或抑制其翻译,是一种基因转录后的调控。miRNAs与肿瘤密切相关,但是特异性miRNAs如何通过靶基因调控肾母细胞瘤的发生、发展过程的详细机制还需要进行深入研究。本研究通过miRNAs芯片技术和生物信息学等方法筛选肾母细胞瘤组织中差异表达的关键miRNAs,选定miR-140-5p为研究对象,寻找并验证miR-140-5p的靶基因TGFBR1和IGF1R并进行功能验证。进一步研究了 miR-140-5p通过调控靶基因TGFBR1和IGF1R所在的信号通路TGF-β和IGF-1来影响肾母细胞瘤的增殖和侵袭的分子机制。目的证实miR-140-5p抑制肾母细胞瘤的增殖和侵袭;明确miR-140-5p通过调控TGF-β和IGF-1信号通路影响肾母细胞瘤增殖和侵袭。方法1.采用miRNA表达谱芯片检测肾母细胞瘤组织和瘤旁非肿瘤肾组织中的miRNA表达谱。发现差异表达miRNAs。2.通过对芯片结果的生物信息学分析和茎环实时荧光定量PCR方法验证,最终筛选出miR-140-5p为研究对象。3.慢病毒感染的方法建立稳定表达miR-140-5p的肾母细胞瘤细胞株G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p;MTS法检测不同处理组细胞的增殖率;流式细胞术分析细胞周期;迁移实验分析细胞株侵袭能力。4.生物信息学软件预测miR-140-5p对其关键靶基因的调控位点;同时双荧光素酶报告基因方法验证miR-140-5p对其关键靶基因TGFBR1和IGF1R 3’UTR区的调控作用。5.ELISA方法检测细胞上清中FGF9含量,免疫印迹实验检测靶基因TGFBR1和IGF1R的表达情况,同时检测两者所在的信号通路TGF-β通路的下游蛋白Smad2/3,FGF9,ERK和AKT与IGF-1通路的下游蛋白AKT的表达情况。6.回复实验验证miR-140-5p对TGFBR1和IGF1R的特异性抑制作用。7.统计学方法:SPSS 13.0录入数据,计量资料以均数±标准差,采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验。*p<0.05认为有统计学意义。结果1.miRNA表达谱芯片检测肾母细胞瘤组织和瘤旁非肿瘤肾组织中的miRNA表达谱,发现大量差异表达miRNAs。生物信息学分析选择miR-140-5p为关键miRNAs。Q-PCR方法扩大样本验证miR-140-5p在肾母细胞瘤组织中呈低表达状态。2.慢病毒感染的方法建立稳定表达miR-140-5p的肾母细胞瘤细胞株G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p。miRNA 无关序列(miRNA-NC)作为对照组,与对照组相比,过表达G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p组增殖率出现明显降低(p<0.05);细胞周期组织在G0/G1期。迁移实验发现,G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p组细胞覆盖率比miRNA-NC组明显降低。3.双荧光素酶报告基因实验表明miR-140-5p能够对TGFBR1和IGF1R基因的3’UTR起抑制性调控作用;基因沉默实验和免疫印迹实验进一步证实miR-140-5p能够抑制TGFBR1和IGF1R蛋白的表达。4.与miRNA-NC组相比,免疫印迹实验发现G401mim-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p组TGFBR1和IGF 1R蛋白的表达出现下降。同时TGFBR1下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT蛋白也出现表达降低;IGF1R及其下游蛋白P-AKT蛋白也出现表达下降。5.在 G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p细胞中分别回复 TGFBR1 和 IGF1R表达,发现TGFBR1及其下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT均可以回复表达;IGF1R及其下游蛋白P-AKT也可以回复表达;回复蛋白表达之后细胞的增殖率得到回复。结论1.miR-140-5p在肾母细胞瘤中呈低表达;2.miR-140-5p通过调控TGF-β和IGF-1信号通路影响肾母细胞瘤增殖和侵袭。