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背景:本论文通过系统梳理“小儿情志异常”与“肝常有余”理论的形成源流与主要文献,在本课题组已充分证明调肝治法方药(加味四逆散、逍遥散)可有效抗心理应激抑郁的基础上,结合小儿青少年“肝常有余”的生理病理特性,总结青少期情志异常须从肝论治。运用中药加味四逆散干预青少期应激动物模型,揭示中医药抗抑郁诊治方法的主要机理,明确青少期抑郁发生机制,为进一步寻求有效的干预手段和临床研究提供参考依据。目的:本研究通过总结小儿“肝常有余”理论的发展,采取小儿青少期慢性不可预知应激动物模型(CUMS)模拟小儿受外在刺激的状态,运用中药加味四逆散干预,初步探索调肝方药的干预效果及中医药防治的作用途径,为加味四逆散治疗小儿青少期情志疾病的临床应用提供实验依据,进一步阐明肝常有余基础上的小儿青少期情志异常当从肝论治,对中医药防治小儿青少期情志异常的发展具有重要意义。方法:取21d龄、SPF级、雄性、Wistar大鼠为研究对象,随机分为空白组、模型组、氟西汀干预组、加味四逆散组。采取慢性不可预知应激模型,束缚、电击、强光及频闪灯照射、禁水24h、禁食24h、拥挤、噪声、鼠笼倾斜、潮湿环境、气味刺激、昼夜颠倒、声波刺激共12种方式,每日随机两种,一般上午和下午各安排一种,使动物无法预测应激刺激的发生。21d起开始造模至第44d取材;44d-55d正常喂养不予造模及给药,至第56d取材;第57d开始,继续采取慢性不可预知应激模型造模21d后正常喂养至第86d取材。观察大鼠的一般情况、体重、糖水消耗情况及旷场实验情况,并采用免疫组织化学染色法观察海马CA1区神经元细胞形态,5-HT1AR及5-HTT阳性细胞的分布及数量的变化;通过RT-PCR技术分析,观察加味四逆散对慢性不可预知应激模型大鼠5-HT1AR表达变化。成果:1.一般状况:经过21天慢性不可预知应激造模后,未成年大鼠除空白组外,模型组大鼠活跃度明显降低,毛发缺乏光泽,对声音反应迟钝,饲养员靠近时出现惊恐抱团扎堆的表现;灌胃和应激造模时反抗严重,易怒,大便松散不成形;氟西汀组及加味四逆散组均表现活跃,鼠毛干净整洁有光泽,对声音反应敏感,大便成形;灌胃和应激造模时氟西汀组出现较剧烈的反抗及畏惧,中药组未见该表现。成年期和成年后结果大致同前。2.体重:未造模前,各组间大鼠体重均不存在差异。造模21d的结果提示,与空白组对比,模型组及中药组的大鼠体重明显下降(P<0.01);而成年期的各组大鼠与空白组对比,模型组体重结果有明显的统计学差异(P<0.01),氟西汀组与模型组对比,结果有明显的统计学差异(P<0.01);成年后的各组大鼠,与空白组相比,其余三组体重都有明显的下降,结果有明显的统计学差异(P<0.01);3.糖水消耗实验:各组大鼠的糖水偏爱率无统计学差异,从趋势上分析,青少期以空白组的糖水偏爱率最高,模型组次之,而中药西药组糖水偏爱率较低;成年期模型组糖水偏爱率下降明显,而中药组和西药组与青少期相比糖水偏爱率升高;成年后模型组糖水偏爱率进一步下降,而中西药组成年后持续上升,高于成年后空白组大鼠的糖水偏爱程度。4.活跃度:大鼠的活跃度中以加味四逆散组活跃程度最高,氟西汀组活跃度稍低于中药组,经药物治疗后,中药组及西药组对比模型组有明显的差异,具有统计学意义。5.中央区时间和中央区路程:结果不具有统计学意义,数据的总体趋势为空白组>加味四逆散组>氟西汀组>模型组。6.总区路程:成年期模型组大鼠与空白组的结果对比有差异;中药组、西药组与模型组也有明显的差异:成年后大鼠中,与模型组对比,中药组大鼠的总路程变化有明显的差异;氟西汀组的总路程与空白组及中药组对比,都有明显的差异。7.大鼠海马CA1区细胞形态的改变:空白组:大鼠青少期HE染色切片未见明显异常;成年期切片有少量神经元深染;成年后切片个别神经元萎缩、深染;模型组:大鼠青少期见较多神经元萎缩、深染,胞核、胞浆界限不清;成年期见大量神经元深染,胞核、胞浆界限不清,少量胶质细胞增生;成年后CA1区大量神经元胞核固缩,胞浆嗜酸性增强,局部神经元缺失;小胶质细胞增生,少量嗜酸性粒细胞浸润;氟西汀组:青少期个别神经元萎缩,胞体深染;成年期少量神经元萎缩、深染,胞体细长;成年后较多神经元萎缩、深染,胞浆尼氏体减少,少量胶质细胞增生;加味四逆散组:大鼠青少期见个别神经元萎缩、深染;成年期少量神经元萎缩、深染,胞核、胞浆界限不清;成年后少量神经元萎缩、深染。8.5-HT1AR、5-HTT 蛋白表达:5-HT1AR:青少期中,与空白组对比,模型组结果有统计学差异(P<0.05);成年期的各组大鼠结果无统计学差异,呈现空白组>加味四逆散组>氟西汀组>模型组的趋势;成年后各组的结果中,与空白组对比,模型组有明显的统计学差异(P<0.01)。在同一组内不同时间的比较上,模型组各时间段的结果有明显的统计学意义(P<0.01),其中青少期和成年后对比有明显的统计学意义(P<0.01);氟西汀组各时间段的结果有明显的统计学意义(P<0.01),其中青少期和成年后对比,成年期和成年后对比结果有统计学意义(P<0.05)。5-HTT:不同组别的对比中,成年期模型组与空白组结果有明显的统计学差异(P<0.01);中药组与空白组有统计学差异(P<0.05);氟西汀组与模型组对比,结果有统计学差异(P<0.05);成年后氟西汀组与模型组对比,结果有明显的统计学差异(P<0.01)。同一组不同时间的对比中,空白组间的数据结果有明显统计学意义,其中青少期和成年期对比,有明显的统计学意义(P<0.01)。9.5-HT1AR mRNA表达:各组大鼠5-HT1AR mRNA表达量无统计学差异(P>0.05),从趋势上分析,同一时期不同组间可见,青少期中各组大鼠5-HT1AR mRNA表达量空白组最高,氟西汀低于空白组,其次是加味四逆散,模型组的mRNA表达量最低;成年期的表达趋势与青少期基本一致;成年后除空白组外,各组表达量较接近,趋势仍以空白组>氟西汀组>加味四逆散组>模型组排列。结论:1.加味四逆散对于采用慢性不可预知性应激小儿青少期抑郁症模型大鼠的一般状况、活跃度、兴趣减退及快感缺失有一定的改善作用。同时,结合成年期及成年后的结果提示,小儿青少期曾受慢性不可预知刺激的模型大鼠,在成年期及成年后接受刺激后,抑郁程度进一步加深。2.加味四逆散可改善海马CA1区神经元细胞的受损状况,一定程度上逆转抑郁引起的海马神经元细胞形态结构的改变,对应激损伤的海马具有一定保护作用。3.加味四逆散有助于改善海马CA1区5-HT1AR、5-HTT的蛋白表达。本研究提示,加味四逆散能有效改善突触后5-HT1AR的表达,调节突触后5-HT1AR功能,加强5-HTT转运体在突触间重吸收的功能。综上所述,青少期曾受慢性不可预知应激的大鼠,在成年后受到刺激后,可能导致抑郁症的复发,甚至加重抑郁症的病情。加味四逆散可改善慢性应激造成大鼠海马内5-HT1AR、5-HTT蛋白表达水平的下降。加味四逆散改善慢性不可预知应激引起的情志异常的机制可能是通过上调5-HTT表达,进而影响突触后5-HT1AR的表达而发挥。结合加味四逆散对CUMS大鼠行为学及CA1区细胞形态的改善,我们认为:通过上调5-HTT表达,影响突触后5-HT1AR的表达,从而改善海马神经元功能的修复及促进海马细胞再生可能是加味四逆散干预CUMS模型大鼠的作用机制之一,但具体通路还需进一步实验证明。