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四碳二羧酸,是一种重要的食品饮品添加剂,同时作为重要的化学结构物质,是许多重要化合物的前体,如丁二醇类,四氢呋喃,内丁酮等。微生物发酵法生产这些产品具有特异性强,生产条件温和,环境污染压力小的特点,因此随着微生物发酵产业与合成生物学的飞速发展,这类化合物的生产也在逐渐向微生物发酵的生产方式转变。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于其抗逆性强,耐酸适宜在低pH的条件下生长,能够快速利用葡萄糖等发酵性碳源,同时适用于大规模工业化生产等特点,使其成为用于生产苹果酸和琥珀酸等四碳二羧酸的良好出发菌株。尽管酿酒酵母利用葡萄糖时优先进行酵解代谢并生产乙醇,但可以通过三羧酸循环和乙醛酸循环等途径产四碳二羧酸。本论文在酿酒酵母中建立一种四碳二羧酸苹果酸的生产途径,从糖酵解中高能荷的代谢中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)经草酰乙酸产苹果酸。通过过表达定位到胞质中苹果酸脱氢酶基因cMDH3和粟酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白基因SpMAE1在酿酒酵母中,加速了苹果酸的生成和向细胞外的排出。通过过表达不同来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pp(E.coli)或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck(E.coli),PCKJ(Saccharomyces cerevisiae)及其突变体 PCKlE23K强化 PEP流向苹果酸的代谢流。重组菌株苹果酸合成能力有显著提高。在2%葡萄糖分批发酵中,48小时苹果酸,琥珀酸总产量由0.22g/L提高达到0.60g/L(苹果酸0.24g/L,琥珀酸 0.36g/L),72 小时达到 1.07g/L(苹果酸 0.43g/L,琥珀酸 0.64g/L)。进而,我们同时通过点突变,启动子替换或去除启动子上游增强序列的方式将酵母菌株丙酮酸激酶活性由7.13 U/mg蛋白下降到0.55 U/mg蛋白。最终获得的工程菌株YMAT23,在2%葡萄糖分批发酵中,18h时苹果酸产量即达到最高,为0.31 g/L。在后继工作中我们将通过优化分批补料发酵条件,研究该菌株最终能够达到的生产水平。