论文部分内容阅读
目的:1、体外培养人脂肪干细胞及黄芪甲苷孵育的脂肪干细胞,以PKH26红色荧光染色剂标记脂肪干细胞,观察PKH26标记对干细胞形态、表面分子表达以及成骨、成脂分化能力有无影响;2、观察经PKH26标记的黄芪甲苷孵育的脂肪源性干细胞体内移植联合激素治疗对MRL/lpr小鼠（自发性狼疮模型小鼠）的影响。方法:1、根据前期筛选的黄芪甲苷（Ast）孵育的人脂肪干细胞（h ADSCs）的最佳孵育条件,选取P3-P5代的干细胞进行实验。以PKH26荧光染色剂标记h ADSCs及Ast-h ADSCs,待细胞贴壁后于光镜下及荧光显微镜下观察干细胞形态;流式细胞仪检测经PKH26标记后的h ADSCs、Ast-h ADSCs的阳性标记率及细胞表面标志物的表达（CD分子）;光镜及荧光显微镜下观察经PKH26荧光染色剂标记后的脂肪干细胞成骨、成脂情况。2、根据预实验确定小鼠发病时间及干预时间,将25只MRL/lpr小鼠随机分为5组,于第11周龄时开始干预。其中模型组予以尾静脉注射生理盐水;激素组以8.75 mg/kg的醋酸泼尼松剂量予以每日灌胃治疗;h ADSCs组及Ast-h ADSCs组小鼠以每周一次1×10~6个/细胞的剂量进行尾静脉输注治疗;激素+Ast-h ADSCs组在每周一次输注1×10~6个/细胞的同时每日予以同等剂量的醋酸泼尼松灌胃治疗,所有小鼠共干预1个月。将5只C57BL/6J鼠作为正常对照组。于第9周、第11周、第15周时留取小鼠尿液标本以检测尿蛋白/尿肌酐比值;于最后一次输注细胞悬液后第7天即第15周时称重、拍照、眼眶静脉采血并留取小鼠脾组织以及淋巴组织标本,评估淋巴结评分并计算小鼠脾指数和淋巴结指数;留取肾组织标本进行HE染色、PAS染色及MASSON染色观察肾组织病理学改变、免疫荧光法观察肾组织中的Ig G、C3、C1q的沉积情况;生化仪检测小鼠血肌酐、尿素氮水平;ELISA检测小鼠血清中的抗ds-DNA抗体、C3补体及细胞因子IFN-γ、IL-4的水平并计算IFN-γ/IL-4值;激光共聚焦观察h ADSCs及Ast-h ADSCs在狼疮小鼠肾脏分布情况。结果:1、PKH26标记情况:PKH26标记后h ADSCs及Ast-h ADSCs两组细胞形态上无明显差异,呈梭形、成纤维细胞样,漩涡状、放射性生长;荧光镜下可见细胞胞膜、胞浆发出红色荧光。流式细胞仪显示,经PKH26染色剂标记后的h ADSCs及Ast-h ADSCs两组细胞的PKH26阳性标记率分别为99.6%和99.7%,表面分子的表达分别为CD29（96.3%VS 95.5%）、CD44（99.9%VS 99.9%）、CD34（1.73%VS2.44%）、CD45（0.14%VS 0.1%）;且经PKH26染色剂标记后的h ADSCs及Ast-h ADSCs两组干细胞仍然具有多向分化能力,其成骨、成脂能力未受明显影响。2、Ast-h ADSCs联合激素治疗后对MRL/lpr小鼠的影响（1）尿ACR水平:留取实验小鼠9周、11周、15周的随机尿液,检测尿蛋白和尿肌酐含量,计算尿蛋白/尿肌酐比值。9周、11周的各组小鼠ACR差异无统计学意义（P＞0.05）。第15周时,与模型组相比,各干预组均能明显改善小鼠的尿蛋白水平（P＜0.01）,且Ast-h ADSCs+激素组治疗效果优于激素组、h ADSCs组及Ast-h ADSCs组（P＜0.01）。（2）血Scr、BUN水平:15周时,留取血清使用生化仪检测小鼠血Scr、BUN水平。Scr:模型组高于对照组和Ast-h ADSCs+激素组（P＜0.05）;BUN各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）抗ds-DNA抗体及C3补体水平:于15周时,ELISA法检测各组小鼠血清中的抗ds-DNA抗体滴度及C3水平,结果显示模型组抗体滴度明显高于各组（P＜0.01）;其中,Ast-h ADSCs+激素组能显著降低小鼠体内的抗体滴度,效果优于激素组（P＜0.05）,且明显优于h ADSCs组及Ast-h ADSCs组（P＜0.01）;各组小鼠C3水平未见明显差异,但可见干预组小鼠C3水平呈上升趋势。（4）IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平:与模型组相比,Ast-h ADSCs+激素组能够明显的降低小鼠血清中的IFN-γ、IL-4水平（P＜0.01）,但激素组的IL-4水平无明显变化（P＞0.05）;且与模型组相比,Ast-h ADSCs+激素组能够提高IFN-γ/IL-4比值,且其效果优于其他三个干预组（P＜0.01）。（5）脾指数及淋巴指数变化:模型组小鼠出现明显脾肿大现象,与模型组相比,各干预组能降低小鼠脾指数（P＜0.01）,且Ast-h ADSCs+激素组脾指数明显降低,效果优于激素组、h ADSCs组及Ast-h ADSCs组（P＜0.05）;在淋巴结肿大方面,与模型组相比,Ast-h ADSCs+激素组在改善小鼠淋巴结评分上的效果优于激素组、h ADSCs组及Ast-h ADSCs组（P＜0.05）,能够显著降低小鼠淋巴结评分（P＜0.01）;与模型组相比,各组均能显著降低小鼠的淋巴指数（P＜0.01）,且Ast-h ADSCs+激素组效果优于激素组及h ADSCs组（P＜0.01）。（6）肾脏组织学改变:HE、PAS、MASSON三种染色方法观察小鼠肾组织学改变。HE染色可见正常组小鼠肾组织结构基本正常,模型组小鼠可见有新月体形成,刷状缘脱落明显,核碎裂,与同时间点模型组相比,激素组、h ADSCs组与Ast-h ADSCs组小鼠肾小球未见明显新月体形成,但可见小球增大,肾小管损伤,肾间质及小球周围有炎性细胞浸润;Ast-h ADSCs+激素组则未见明显损伤;PAS染色可见模型组小鼠系膜细胞、系膜基质增生明显,肾小球上皮及内皮下可见大量的嗜复红蛋白的沉积;激素组、h ADSCs组与Ast-h ADSCs组仍有部分系膜细胞及系膜基质增生情况,可见少量的嗜复红蛋白的沉积;Ast-h ADSCs+激素组可见少量的系膜细胞及系膜基质增生,未见明显的嗜复红蛋白沉积;MASSON染色可见模型组肾小球代偿性增大,较多的新月体（细胞性或细胞纤维混合性）形成,部分肾间质轻度纤维化;与模型组相比,激素组及h ADSCs组可见新月体数量减少,肾小球系膜细胞及系膜基质增生,Ast-h ADSCs组和Ast-h ADSCs+激素组可见轻度肾间质纤维化,未见明显的新月体形成。（7）肾组织免疫复合物沉积情况:Ig G、C3以及C1q主要在小鼠肾脏的系膜区呈颗粒或团块样沉积。模型组可见大量免疫复合物沉积,荧光较强;相比于模型组,激素组、h ADSCs组与Ast-h ADSCs组可见免疫复合物沉积较少,而Ast-h ADSCs+激素组较其他干预组荧光强度弱。荧光半定量分析结果显示:h ADSCs组、Ast-h ADSCs组及Ast-h ADSCs+激素组在减轻Ig G、C3沉积的效果上要优于激素组（P＜0.01）;在减轻C1q沉积效果上,Ast-h ADSCs+激素组要优于h ADSCs组、Ast-h ADSCs组（P＜0.01）,且均优于激素组（P＜0.01）。（8）h ADSCs及Ast-h ADSCs在肾组织的分布:激光共聚焦结果显示,h ADSCs组、Ast-h ADSCs组及Ast-h ADSCs+激素组在肾组织有少量红色荧光表达,其中少量红色荧光定植于肾小球内;对照组、模型组及激素组未见红色荧光表达。结论:1、PKH26荧光染色剂标记对人脂肪干细胞形态、干细胞表面分子表达及干细胞分化能力无明显影响,基本保持了h ADSCs及Ast-h ADSCs的生物学特性,这对后期追踪干细胞体内移植提供了强有力的保证。2、MRL/lpr小鼠作为SLE常用模型小鼠,可表现出与人类相似的症状。Ast-h ADSCs移植联合激素治疗能够显著的降低MRL/lpr小鼠的抗ds-DNA滴度;下调细胞因子（IFN-γ、IL-4）水平,调节Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）的平衡;降低小鼠的脾指数和淋巴结指数,改善小鼠的脾肿大及淋巴结病病变程度。3、Ast-h ADSCs移植联合激素可改善LN模型小鼠的肾脏损伤情况,其修复作用可能通过调节免疫失衡,从而改善肾功能、降低小鼠尿蛋白、减少免疫复合物在肾脏的沉积。