平足蛋白(Podoplanin,PDPN),一种来自人的38 kDa跨膜唾液酸糖蛋白,在淋巴管内皮细胞中表达而不是在血管内皮细胞中表达,因此被认为是淋巴管内皮的标志物。迄今为止,只有D2-40抗体已经用于病理诊断,但D2-40抗体售价昂贵,且由国外生产。因此,我们尝试构建载体表达PDPN用于免疫,并通过细胞融合制备用于IHC诊断的单克隆抗体。在本研究中,选择PDPN胞外部分的基因进行优化和合成,并插入载体pET-28a和pGEX-6P1 中以分别表达PDPN-His 6和GST-PDPN融合蛋白。将GST-PDPN重组蛋白与快速佐剂混合注射到BALB/c小鼠中,使用PDPN-His 6融合蛋白作为包被抗原,通过ELISA法测定抗血清的滴度。细胞融合和筛选后,获得了一株稳定分泌PDPN抗体的单克隆细胞株,命名为5B3。该细胞株分泌IgG2b型抗体,染色体数目是102±4。通过Protein G方法从腹水中纯化抗PDPN的单抗后,5B3单抗的效价达到1.28×105,亲和常数为2.94×108 L/mol。5B3单抗在4℃或37℃保存不同天后,结果显示抗体保持高的稳定性。此外,在ELISA、Western Blot和免疫组织化学(免疫组化)中,特别是在人的组织,包括肺组织、间皮瘤、精原细胞瘤、粘膜下淋巴管和甲状腺切片中,5B3单抗表现非常高的特异性,表明5B3单抗有助于鉴别原发性淋巴浸润的肿瘤。因此,本研究成功开发了用于IHC诊断的抗PDPN单抗,有利于降低医疗检测成本,打破国外垄断,实现国有自主产权,为相关肿瘤的治疗和预后提供指导。