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雄性特异性抗原,通常也称为雄性特异性弱组织相容性Y抗原,简称H-Y抗原。早期研究认为H-Y抗原是引起雌鼠对来自遗传性质相同的雄鼠皮肤移植片排斥反应的物质总称。血清学检测研究发现H-Y抗原位于雄性动物细胞膜,是一组雄性特异性基因的表达产物,检测哺乳动物早期胚胎细胞膜上是否存在H-Y抗原,即可鉴定胚胎的性别。H-Y抗原在异性间组织移植的排斥反应和性别控制等方面的研究中具有重要的理论和实践意义。由于H-Y抗原是一种弱抗原,导致常规免疫学方法无法获得高效价、高特异性的H-Y抗血清,而采用杂交瘤技术制备的H-Y单克隆抗体的效价不能得到明显的提高,限制了H-Y抗体在性别控制方面的应用。噬菌体抗体库技术也称抗体基因组合文库技术,它利用抗体基因噬菌体库代替B细胞克隆在体外表达抗体,具有多样性足够、生产周期短、技术灵活方便和筛选范围广等特点,是获得备种抗体的有效途径,而且噬菌体抗体的体外亲和力成熟可突破体内亲和力成熟的界限,能够使抗体的亲和力达到超自然的强度,噬菌体抗体库技术为H-Y抗体效价的提高提供了可能。本研究以鼠源性抗雄性特异性抗原的初级噬菌体抗体库为基础,借助链替换技术对该库进行亲和力提高,并对小鼠早期胚胎进行性别鉴定的初步研究。主要研究内容如下：1.抗血清学检测的H-Y抗原Fab抗体的表达和特异性鉴定为研究抗血清学检测的H-Y抗原噬菌体Fab抗体的可溶性表达及其特异性,通过SpeⅠ和NheⅠ双酶切重组噬质粒,除去噬菌体gⅢ基因,经T4 DNA连接酶的作用后,构建Fab抗体的可溶性表达噬质粒。以IPTG诱导上述含重组质粒的阳性XL1-Blue菌液表达Fab抗体,利用免疫荧光FITC/DAPI共染技术和ELISA分析其特异性。结果表明,该抗体在约49 kD处有条带出现。在Fab抗体和H-Y抗血清的细胞免疫荧光比较分析试验中发现,从雌雄鼠脾细胞的阳性细胞数量和平均荧光强度的角度分析,Fab抗体的雄性特异性强于抗血清。石蜡切片免疫荧光定量分析显示Fab抗体与雄鼠肝脏的结合活性明显高于对应雌鼠,差异极显著(t=20.73,P=0.0023<0.01),而H-Y抗血清与雄鼠肝脏的结合活性略高于对应雌鼠,差异显著(t=7.11,P=0.0192<0.05)。以C57BL/6雄鼠脾细胞、睾丸细胞作为抗原的ELISA分析显示Fab抗体具有雄性特异性,但Fab抗体的OD值低于抗血清。结果提示,Fab抗体的雄性特异性高于H-Y抗血清,但其雄性特异性结合活性低于H-Y抗血清,Fab抗体具备雄性特异性的同时,仍有少量雌性非特异性结合,Fab抗体的体外亲和力成熟可作为后续研究工作以获得高亲和力、高特异性的可溶性Fab抗体分子。2.利用链替换技术提高抗血清学检测的H-Y抗原Fab抗体的亲和力提取雌性C57BL/6小鼠脾组织总RNA,反转录成cDNA,以其为模板扩增多样性小鼠Fab抗体基因,利用噬质粒pComb3,分别构建抗体轻链和重链基因文库。利用Sac I、Xba I双酶切轻链基因文库和原始克隆A8的重组噬质粒pComb3+K+fd,经T4 DNA连接酶的作用,构建了Fab抗体的轻链替换库,经过辅助噬菌体超感染,构建鼠源性次级噬菌体抗体库。通过雄、雌鼠脾细胞的“吸附-洗脱-扩增”筛选和ELISA分析,获得轻链替换后亲和力得到提高的克隆,将该克隆的轻链基因与重链库中的多样性fd段基因随机组合克隆到噬质粒pComb3,构建重链替换噬菌体抗体库,然后进行超感染、筛选和ELISA分析,挑选出高亲和力的抗血清检测的H-Y抗原噬菌体Fab抗体。研究发现,轻链替换的重组率约为80%,库容量7.6×107,重链替换库重组率约为70%,库容量6.4x107。抗体库筛选结果表明,噬菌体抗体亲和力及特异性逐渐得到提高。轻链或重链替换的噬菌体抗体库在第5轮筛选的回收率分别增加约35或15倍,从最后一轮挑取的25个单菌落制备噬菌体抗体,经ELISA检测,轻链替换的噬菌体抗体有8个(32%)显示较好雄性特异性结合活性,重链替换的噬菌体抗体有12个(48%)显示较好雄性特异性结合活性,重链替换后最佳克隆B9的OD值由原始克隆A8的0.505提高到0.961,约为1.90倍,从该角度分析,链替换后噬菌体抗体的亲和力有所提高。3.高亲和力Fab抗体的特异性分析采用pComb3载体和XL 1-Blue菌株对重链替换后的高亲和力Fab抗体基因进行表达,并利用已经建立的免疫荧光FITC/DAPI共染和ELISA方法分析其生物学活性,采用IMGT在线工具分析基因序列。在昆明系雌雄小鼠脾细胞与高亲和力B9 Fab抗体的细胞免疫荧光鉴定中发现,高亲和力B9 Fab抗体与雄鼠脾细胞亲和力强于雌鼠,从雄雌鼠脾细胞平均荧光强度对比的角度分析,重链替换的高亲和力B9 Fab抗体的雄性特异性(约3.62倍)强于原始克隆A8 Fab抗体(约2.07倍),而且筛选到的高亲和力B9 Fab抗体能够与睾丸组织特异结合,与卵巢反应不明显。原始克隆A8 (Fab-Kl, Fab-fd1)与高亲和力阳性克隆B9(Fab-κ2,Fab-fd2)的轻链和fd基因的CD3区比较分析发现,多个位点发生突变,提示CD3区位点的突变和长度的增加可能参与亲和力的提高。4.利用高亲和力Fab抗体鉴定小鼠早期胚胎性别利用间接免疫荧光法对70枚昆明系小白鼠桑椹期和囊胚期胚胎进行性别鉴定,参照已经建立的PCR法扩增SRY基因和常染色体113基因序列,验证性别鉴定准确率。28枚桑椹期和囊胚期胚胎有强荧光,判定为雄性胚胎,经PCR法验证,准确率(两种方法的符合率)为82.14%。36枚桑椹期和囊胚期胚胎呈灰绿荧光或透明带出现灰绿荧光环,判定为雌性胚胎,经PCR法验证,准确率为88.57%,从上述结果可判断B9 Fab抗体对血清学检测的H-Y抗原具有良好的特异性,但还需通过后续大量的动物实验来证明。本研究开发了H-YFab抗体性别鉴定的实际应用潜能,高亲和力H-YFab抗体的筛选与制备将有助于揭示血清学检测的H-Y抗原和抗体的分子基础,为作用机理独特、具有复杂性的血清学检测的H-Y抗原的相关研究和生产应用提供理论依据。