目的: 妊娠是一个复杂的生理过程，从免疫学角度看妊娠过程类似于器官移植，对母体而言是一个“移植物”，母体免疫系统对此进行识别，并产生免疫应答。滋养层，即人孕体的外层部分，在植入及胎盘形成过程中发挥关键作用，这两过程是胎盘和母体组织问直接对话的结果，由细胞膜表面的配体和受体在激素及局部释放的细胞因子的调控下完成。研究发现，妊娠子宫内膜中最主要的淋巴细胞是子宫自然杀伤细胞(uterinenaturekillercell，uNK)，其数量在子宫内膜的分泌中、晚期上升，在妊娠第三个月达到高峰(占淋巴细胞总量的70％～80％)。大量uNK浸润植入位点，被认为对调节滋养层侵袭及子宫内膜基质蜕膜化十分重要。目前关于uNK来源存在两种假说：一种观点认为，uNK是由CD16-外周血NK细胞(peripheralbloodnaturalkillercell，pNK)归巢迁移至子宫进一步经组织特异性分化而形成。另一种观点认为，uNK细胞系由外周血CD34+造血干细胞于月经周期迁移到子宫或子宫本身存在的CD34+造血干细胞增殖分化产生。蜕膜CD56brightCD16-NK细胞为何能在子宫内大量聚集，与异质性细胞共存于蜕膜中并起重要调节作用一直是人们关注的焦点，相关的文献也已报道很多。然而，uNK细胞为何能在妊娠早期大量聚集于植入位点，妊娠早期滋养细胞微环境(细胞因子、激素、低氧等)是否能影响uNK细胞的表型转换及募集还未见报道。揭示uNK细胞聚集的机理有助于理解母体的耐受和各种妊娠期间的并发症。 本实验以正常月经周期未妊娠妇女外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMGs)为研究对象，将其培养至来源于妊娠早期胎盘的滋养细胞系HTR-8/SVneo上清中，研究妊娠早期滋养细胞微环境(细胞因子、激素、低氧)对pNK表型转换及募集的影响，达到以下研究目的： 1.将正常外周血单个核细胞(PBMCs)培养于HTR-8/SVneo上清并以激素及低氧刺激，研究妊娠早期滋养细胞微环境对pNK细胞亚群CD56+CD16+、CD56+CD16-表型变化及对趋化因子受体CCR2[chemokine(C-Cmotif)receptor2，CCR2]、CXCR4[chemokine(C-X-Cmotif)receptor4，CXCR4]的影响，探讨妊娠早期滋养细胞微环境对pNK细胞表型转换及募集的影响。 2.观察妊娠早期滋养细胞微环境中HTR-8/SVneo分泌MCP-1(monocytechemoattractantprotein-1)的规律，探讨MCP-1/CCR2在pNK细胞表型转换及募集中可能的机制。 方法: 1.培养HTR-8/SVneo，添加4种激素[孕激素(Progesteron，P)、雌激素(17-βEstrogen，E2)、催乳素(Prolactin，PRL)、绒毛膜促性腺激素(Humanchorionicgonadotropin，HCG)]进行刺激，于2％O2环境下培养72h，收集细胞上清制备条件培养基。 2.分离正常未孕妇女PBMCs，2％O2环境下将其分别培养于正常1640培养基及上述制备的条件培养基，流式细胞术检测PBMCs中pNK细胞表面CD56+CD16+及CD56+CD16-的比例变化及其趋化因子受体CCR2、CXCR4的表达。 3.培养HTR-8/SVneo，以4种激素分别刺激24h～120h，分别于不同时间点收集细胞上清，ELISA检测MCP-1蛋白的表达。固定其中3种激素(E2、PRL、HCG)，以不同浓度孕激素(10-6M、5×10-7M、10-7M)刺激培养HTR-8/SVneo，ELISA检测MCP-1蛋白的表达，探讨孕激素对MCP-1分泌的调控。不同氧压(2％O2及20％O2)刺激培养HTR-8/SVneo，ELISA检测中MCP-1蛋白的表达，分析低氧对MCP-1分泌产生的影响。 4.同时我们也通过流式细胞术检测了HTR-8/SVneo表面CCR2的表达。 结果: 1.PBMCs培养于HTR-8/SVneo上清70h，流式细胞分析pNK细胞表型，与普通培养基培养的pNK细胞相比，其表面的CD56+CD16-及CD56+CD16+表达比例无明显变化(P＞0.05)；CD56+CD16-NK及CD56+CD16+NK表面的CCR2表达均增强，CXCR4表达均减弱，有统计学意义(P均＜0.05)。 2.4种激素刺激培养HTR-8/SVneo不同时间，结果显示，MCP-1蛋白的分泌具有时间依赖性，随着培养时间的延长MCP-1分泌逐步升高。2×105细胞/ml培养24h～72h，MCP-1蛋白水平在72h分泌水平最高，1×105细胞/ml培养72h～120h，MCP-1蛋白水平在120h分泌水平最高。和对照组相比，3种不同浓度孕激素中，5×10-7M、10-7M孕激素刺激培养HTR-8/SVneo72h后分泌的MCP-1蛋白水平明显上调(P＜0.01)，10-7M诱导能力最强。与常氧(20％O2)相比，低氧(2％O2)并未影响MCP-1蛋白的分泌(P＞0.05)。 3.流式细胞术检测到HTR-8/SVneo表面低表达CCR2。 结论: 1.妊娠早期滋养细胞微环境能导致CD56+CD16-NK及CD56+CD16+NK细胞表面CXCR4向uNK细胞表型转换。 2.妊娠早期滋养细胞微环境能导致CD56+CD16-NK及CD56+CD16+NK细胞表面CCR2表达增强，MCP-1/CCR2可能参与pNK细胞的表型转换及募集。 3.妊娠早期滋养细胞微环境中高表达MCP-1，其表达主要受激素的调控而可能与低氧无关。其中孕激素具有关键作用。 4.MCP-1/CCR2可能与滋养层细胞的侵袭有关。