论文部分内容阅读
白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）是Okamura等（1995）从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等（2003）研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着畜牧业的发展,禽病特别是禽流感呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发,而禽流感病毒的主要抗原决定簇位于HA1基因,故HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。鉴于此,本实验室对鸡白介素18成熟蛋白基因（mature Chicken interleukin-18,mChIL-18）与HA1基因进行了真核双表达,旨在探索利用mChIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于禽流感的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的mChIL-18蛋白这些问题进行了探讨,主要包括以下两部分:试验一H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建参考GenBank上发表的H5亚型禽流感（AIV）血凝素（HA）基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白（mChIL-18）的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的两对引物。然后分别以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dual-HA1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。试验二H5亚型AIVHA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达将试验一构建好的pFastBacTM dual-IL-18-HA1质粒转化DH10Bac感受态细胞,将转化混合物涂到LB琼脂平板上,用小量法从培养物中提取质粒DNA,在此基础上通过一对通用引物M13(该引物扩增重组质粒Bacmid LacZα互补区域内的mini-attTn7位点两端的片段,任何外源性基因片段插入pFastBacTM dual质粒内都会使PCR产物增大)进行PCR扩增,鉴定pFastBacTM dual-IL-18-HA1质粒克隆到杆状病毒表达载体,通过转染昆虫细胞sf9,收获重组杆状病毒,得到了共表达IL-18和HA1的高效表达产物。