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目的Ig A是哺乳动物肠道内含量最丰富的免疫球蛋白,在肠道粘膜免疫中起到重要的作用。Ig A在肠道中主要以粘膜型多见,是B细胞经过进一步分化形成Ig A+浆细胞分泌产生的。Ig A的类别转换机制主要分为T细胞依赖型和T细胞非依赖型两条信号通路途径。鼠李糖乳杆菌GG株(Lactobacillus rhamn osus GG,LGG)是一种提取自人体肠道的革兰阳性益生菌,我们纯化克隆出一种LGG来源的蛋白p40,这种蛋白能够通过ADAM-17促进肝素结合EGF(heparin-binding EGF,HB-EGF)的释放,从而激活肠道上皮细胞的EGFR通路。有研究表明肠道微生物能够促进Ig A的产生,但是具体的作用机制未阐明。本研究旨在探索LGG来源的p40是否通过表皮生长因子受体(Epiderma l growth factor receptor,EGFR)通路调节肠道Ig A的产生。方法1.分离小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,利用免疫磁珠分选技术分离B细胞。利用小鼠肠道上皮(Mouse small intestinal epithelium,MSIE)细胞p40条件培养基和对照条件培养基培养B细胞。利用流式细胞分析技术检测B细胞的Ig A+细胞的表达。ELISA法检测B细胞培养基中Ig A的分泌量。利用RT-PCR技术和Western blot检测p40刺激的MSIE细胞的生长诱导配体(A proliferation inducing ligand,April)的基因和蛋白表达水平。2.利用EGFR抑制剂和si RNA技术敲低EGFR,利用RT-PCR和Western blot技术检测MSIE细胞April的基因和蛋白表达水平。利用Western blot技术检测p40作用于小肠肠道上皮细胞的EGFR/Akt信号通路以及IκB-α磷酸化水平和核因子-κB(Nuclear Factor-kB,NF-κB)亚单位p65的核转移。利用enteroids培养技术建立小肠类器官模型,并用RT-PCR检测April的基因表达水平。3.利用Egfrfl/flVil-Cre小鼠模型在体内研究EGFR通路在p40促进肠道上皮细胞表达April上所起的作用。利用RT-PCR和Western blot技术检测肠道上皮细胞April的基因和蛋白水平。利用免疫荧光技术检测小肠组织Ig A+细胞的比例。利用ELISA技术检测小鼠粪便Ig A的分泌量。建立DSS诱导Egfrfl/flVil-Cre和Egfrfl/fl小鼠肠炎模型,HE染色技术评判肠道组织的炎症程度,并利用RT-PCR技术检测肠道上皮细胞April的基因表达水平。结果1.流式结果显示p40条件培养基培养的B细胞Ig A+B细胞的比例显著高于对照条件培养基(p<0.05),而直接加入p40培养的Ig A+B细胞的比例并没有显著的差异(p>0.05)。ELISA结果显示p40条件培养基培养的B细胞分泌Ig A比对照条件培养基明显增加(p<0.05),而直接加入p40组的Ig A的分泌量与对照组相比无明显变化(p>0.05)。RT-PCR和Western blot结果表明加入p40蛋白MSIE细胞比对照组MSIE细胞的April的基因和蛋白表达量显著增高(p<0.05)。流式细胞检测结果表明,加入April在B细胞表面受体的中和抗体后,Ig A+B细胞的比例明显下降(p<0.05)。ELISA也表明B细胞分泌April的量也显著减少(p<0.05)。2.RT-PCR和Western blot结果表明,加入EGFR通路抑制剂(AG1478和LY294002)和转染si EGFR的MSIE细胞,April的基因表达和蛋白合成作用减弱(p<0.05)。利用Egfrfl/flVil-Cre小鼠分离绒毛隐窝培养类肠状器官(enteroids),在加入p40刺激后,RT-PCR结果显示其April的表达量明显低于Egfrfl/fl小鼠。Western blot检测结果显示p40可增加EGFR和Akt的磷酸化水平。P40能促进IκB-α的磷酸化,并且这种作用具有时间依赖性。P40能够促进NF-κB亚单位p65的核转移,加入EGFR抑制剂和NF-κB抑制剂(PDTC)后核内p65的蛋白量明显降低,同时April的表达水平降低。3.用p40 beads喂养EgfrVil-Cre小鼠和Egfr小鼠,流式细胞技术结果发现Egfrfl/flVil-Cre小鼠的Ig A+细胞数量明显低于Egfrfl/fl小鼠(p<0.05),ELISA结果表明粪便中的Ig A水平明显低于Egfrfl/fl小鼠(p<0.05)。RT-PCR和Western blot的结果表明April的基因表达和蛋白合成均低于Egfrfl/fl小鼠(p<0.05)。HE染色病理评分结果表明Egfrfl/flVil-Cre小鼠的肠道炎症的程度明显高于Egfrfl/fl小鼠。DSS诱导肠道损伤的Egfrfl/flVil-Cre小鼠的April的表达量明显低于Egfrfl/fl小鼠。结论1.利用p40条件培养基与对照条件培养基培养B细胞,发现利用p40条件培养基中Ig A+B细胞比例增加,含有Ig A的量增多,从而证明P40能够通过肠道上皮细胞分泌因子促进B细胞Ig A的产生。利用P40体外处理MSIE细胞,发现p40能够促进MSIE细胞April的基因表达和蛋白合成。在B细胞培养基中加入April的中和抗体,发现Ig A+B细胞比例降低,Ig A分泌量下降,从而证明April可以促进B细胞的Ig A产生。2.通过加入EGFR抑制剂和转染si EGFR进入MSIE细胞,April的基因表达和蛋白合成作用减弱。利用Egfrfl/flVil-Cre小鼠分离肠道绒毛隐窝在体外培养肠状类器官(enteroids),加入p40刺激后,其组织April的表达量明显低于Egfrfl/fl小鼠。体外实验证明p40促进April的基因表达和蛋白合成作用需要EGFR信号通路。通过检测IκB-a磷酸化水平和NF-κB亚单位p65的核转移,可证明p40可通过EGFR通路激活NF-κB通路。应用NF-κB的抑制剂后,April的表达水平降低,证明p40可通过EGFR/Akt/NF-κB通路促进肠道上皮细胞表达April。3.用p40喂养Egfrfl/flVil-Cre小鼠和Egfrfl/fl小鼠,Egfrfl/flVil-Cre小鼠,发现Egfrfl/flVil-Cre小鼠的Ig A+细胞数量明显低于Egfrfl/fl小鼠,粪便中的Ig A水平也明显低于Egfrfl/fl小鼠。肠道上皮细胞April基因表达和蛋白合成均低于Egfrfl/fl小鼠水平。体内实验证明p40可通过EGFR通路促进肠道上皮细胞表达April,从而促进B细胞Ig A的产生。