目的 在动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的发病过程中，一些致病因子刺激动脉壁细胞高度表达单核细胞趋化蛋白1(Monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，从而诱导血液中单核细胞迁移入血管内皮下间隙，构成了AS发病过程中极为重要的早期事件[1]。近年来的研究表明，同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)能够诱导血管平滑肌细胞表达MCP-1[2]。然而，对同型半胱氨酸引起血管内皮细胞NF-κB的激活及其激活的机理研究甚少。因此，进一步研究HCY对NF-κB的激活及其机制，将有利于阐明HCY在AS发病过程中的作用，也为AS的靶向治疗提供重要的理论基础。本论文旨在研究HCY对血管内皮细胞NF-κB的激活，并初步探讨其激活的机制，以明了同型半胱氨酸在动脉粥样硬化发病过程中的作用。 方法 1.人脐静脉内皮细胞的分离及培养 用胶原蛋白酶消化法分离新鲜人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，hUVEC)，种于明胶包被的培养瓶，置37℃、5％C02培养箱内静置培养。培养基为含10％胎牛血清的M199，并添加50ng/L内皮细胞生长添加剂和0.005u/L肝素。待hUVEC融合后，以1∶3的比例传代培养，细胞呈典型铺石样形态。实验所用细胞为第2-3代。实验分组：将HUVEC随机分成实验组和对照组，每组细胞数相同，不同浓度实验组细胞培养基中分别加入不同浓度的HCY(0，0.01，0.05，0.1，0.5mmol/L)，温浴2h；不同时间实验组细胞培养基中加入0.1mmol/LHCY，与血管内皮细胞分别温浴0，0.5，1，2，4h。 2.电泳迁移率试验(ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)提取内皮细胞核蛋白，与反应缓冲液在室温下温浴15min，然后将同位素32P标记的能与NF-κB相结合的寡核苷酸(5-GGGGACTTTCC-3)加入上述反应缓冲液中，在25℃下温浴20min后，将该反应混合物上样于6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后，然后干胶，于-70℃放射自显影于X光片上。 3.免疫荧光染色 培养于载玻片上的内皮细胞于丙酮中固定15min，阻断后，用兔抗人P65蛋白抗体作为一抗，用荧光标记的羊抗兔IgG抗体作为二抗。在激光共聚焦显微镜上进行观察。 4.Westernblotting检测IκB-α的磷酸化 用常规的Westernblotting检测IκB-α的磷酸化，其一抗为兔抗人磷酸化的IκB-α，其二抗为FITC荧光标记羊抗兔IgG。 5.统计学分析 实验数据以x±s表示，用方差分析进行统计学处理，统计学检验水平设在P＜0.05。 结果 1.EMSA证明同型半胱氨酸可以时间依赖和浓度依赖的方式激活血管内皮细胞NF-κB； 2.免疫荧光共聚焦显微镜可见在HCY刺激后的血管内皮细胞，大量的NF-κB-P65蛋白从细胞浆内转移入细胞核内，故NF-κB-P65蛋白染色在细胞核内呈强阳性，而细胞浆内染色较弱； 3.Westernblotting证明HCY能明显地诱导血管内皮细胞IκB-α的磷酸化。 结论 HCY可能通过增强IκB-α的磷酸化，抑制血管内皮细胞IκB-α的活性，从而激活NF-κB，在转录水平对下游的趋化因子和黏附因子产生调节作用，促进动脉粥样硬化的形成和发展。