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西瓜细菌性果斑病是由燕麦食酸菌西瓜亚种Acidovorax avenae subsp. citrulli引起,是一种重要的植物检疫性病害。病原菌可以危害西瓜,哈密瓜,甜瓜等,因此对瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁。该病主要是靠种子传播,因此有必要建立一套快速,准确,便捷的检测西瓜细菌性果斑病菌的方法。本研究采用通用引物扩增了燕麦食酸菌西瓜亚种和燕麦食酸菌卡特莱兰亚种16S rDNA,并扩增了燕麦食酸菌西瓜亚种及其近缘种的ITS序列。根据ITS序列的差异设计并筛选出了可用于燕麦食酸菌西瓜亚种检测的特异引物TIF2: 5-GCT GGA TCA CCT CCT TTC TG -3和TIR3: 5-TGA CGC AAT CAA ATT TTT GTCA-3。对PCR程序进行优化,结果表明,西瓜细菌性果斑病菌可以扩增到一条462 bp的特异片段,而燕麦食酸菌西瓜亚种的近缘种以及本研究供试的其它菌株均扩增不到条带,菌液PCR时,检测的灵敏度为105 CFU/mL,整个过程大约90 min。采用降落PCR扩增了燕麦食酸菌西瓜亚种及其近缘种的gyrB基因,设计了可用于燕麦食酸菌西瓜亚种检测的巢式PCR引物,外侧引物GTF:5-GTG CTC TGC TTC ACC AAC AA CA-3, GTR:5-TCA GGG TCT CTC CGT CCA GG-3;内侧引物GTF2:5-ATC GG CAA GTA CAT CGAGCA GAA T-3; GTR2:5-TCGACGATGTAGATCTCGCTCAGG-3。对巢式PCR程序进行优化,结果表明,西瓜细菌性果斑病菌可以扩增到一条395 bp的特异片段,而燕麦食酸菌西瓜亚种的近缘种以及本研究供试的其它菌株均扩增不到条带,使用巢式PCR对菌液进行检测时,灵敏度为103 CFU/mL,整个过程大约2 h。基于DNA的PCR技术,死细胞和活细胞的PCR结果都为阳性,因此如何在检测的时候排除死细胞的影响成为了研究的热点。本研究探索了DNA染料(Ethidium monoazide)在区别西瓜细菌性果斑病菌死活细胞上的应用,结果显示当死细胞的浓度为小于107CFU/mL时,进行巢式PCR的时候,EMA可以抑制死细胞DNA的扩增。