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研究背景：全球目前有近三分之一的人口感染了结核分枝杆菌(Mtb)，其中5~10%可发展为结核病(TB)，而且TB仍是近年来世界上因感染单一病原体而死亡的最重要病因之一。如何快速诊断出结核病是治疗结核、控制结核的重点项目之一。检测结核杆菌感染的试剂盒(T-SPOT-TB)根据免疫应答及回忆反应的原理，用ESAT6/CFP10刺激CD4+T细胞产生IFN-γ，但这种试剂盒不能区分Mtb隐匿性感染者(以下简称隐感者)与TB患者。近年已证实了γδT细胞在结核感染中的免疫作用。γδT细胞对Mtb抗原的刺激有增殖反应并产生IFN-γ。与正常人(HD)或隐感者相比，TB患者γδT细胞对Mtb抗原刺激后的增殖反应降低，而γδT细胞产生IFN-γ(Tγδ1细胞)的能力有何不同尚不清楚。已报道不同细胞因子可诱导小鼠γδT细胞产生IL-17(Tγδ17细胞)。但诱导人γδT细胞产生IL-17的调控机制以及Mtb抗原的影响，也还有待探讨。目的：检测HD，TB患者经分离外周血单个核细胞（PBMC）培养增殖后用Mtb-HAg刺激后T细胞亚群产生IFN-γ和IL-17的变化。观察不同细胞因子和Mtb抗原在诱导γδT细胞产生IL-17中的作用。以阐明隐感者和TB患者之间γδT细胞的天然和特异性免疫的差异，以及为TB患者不同病程期间的免疫功能状态提供新的判定指标。方法：1.流式细胞术检测Mtb-Ag刺激γδT细胞产生IFN-γ1.1采集3例HD外周血，加入Mtb-HAg刺激培养10h，14h，18h后，再加入莫能霉素（Monensin）继续培养6h，收集细胞，加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测产生IFN-γ的T细胞亚群比例。1.2采集隐感者和TB患者外周血，分别用磷酸化抗原HDMAPP、Mtb-HAg和Mtb-HAg(10K)刺激培养14h，再加入莫能霉素（Monensin）继续培养6h，收集细胞，加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测产生IFN-γ的T细胞亚群比例。1.3收集HD和TB患者外周血分离PBMC经培养增殖12天后的细胞，用或不用Mtb-HAg刺激培养2h，再加入莫能霉素（Monensin）继续培养4h，收集细胞，加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测γδT细胞中产生IFN-γ和IL-17细胞的相对比例。2.ELISPOT方法检测隐感者和TB外周血T细胞亚群产生IFN-γ和IL-172.1运用结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点诊断试剂盒从HD人群中筛选隐感者，采集HD外周血分离PBMC调整细胞数，按实验设计每孔加入细胞悬液将ELISPOT板置于37℃培养20h后，进行洗涤孵育显色，最后进行斑点计数统计，每10万个细胞中产生IFN-γ细胞数。2.2采集隐感者和TB患者外周血分离PBMC，取一部分细胞进行免疫磁珠的分选收集无γδT细胞（γδˉ）的PBMC，再将这两部分细胞调整细胞数按实验设计每孔加入细胞悬液将ELISPOT板置于37℃培养20h后，进行洗涤孵育显色，最后进行斑点计数统计，每10万个细胞中产生IFN-γ和IL-17细胞数。3.Mtb-Ag和细胞因子(CK)对γδT细胞激活诱导产生IL-17和IL-17﹢IL-22﹢采集HD外周血分离PBMC，加入Mtb-HAg、HDMAPP、Mtb-SoAg和细胞因子（IL-1β、TGF-β）培养3天后，加入rIL-2刺激培养，第9天加入IL-23继续培养至12天，使其成为富含效应性γδT细胞的细胞群，收集细胞用PMA/Ionomycin和Monensin刺激培养6h，流式细胞仪检测产生IL-17和IL-17+IL-22+的γδT细胞亚群比例。结果：1.Mtb-HAg刺激HD外周血（n＝3）第16h开始，γδT细胞中产生IFN-γ的细胞逐渐增多，至20h时和24h时，分别为3.33%和3.50%。2、用Mtb感染T细胞诊断ELISPOT试剂盒检测从HD人群中筛选隐感者，利用判定阳性标准从17例HD人群中筛选出11例隐感者。3、隐感者经不同抗原刺激20h后用流式细胞术检测发现，αβT细胞和γδT细胞均能产生IFN-γ，而产生IFN–γ的γδT细胞比αβT细胞多。αβT细胞和γδT细胞中IFN-γ+细胞比率在HDMAPP刺激组（n＝6）（0.45%和7.42%），Mtb-HAg刺激组（n＝11）（0.42％和5.63％），Mtb-HAg(10K)组（n＝8）（0.61％和7.6％）中比较，均有明显差异（p<0.05）。TB患者经不同抗原刺激20h后，γδT细胞中产生IFN-γ细胞也比αβT细胞中的多。在HDMAPP刺激组（n＝6）（2.0%，3.35%），Mtb-HAg刺激组（n＝12）（0.87％和2.11％），Mtb-HAg(10K)组（n＝10）（0.64％和2.35％）。各实验组中αβT细胞和γδT细胞中IFN-γ+细胞比率的比较均有明显差异（p<0.05）。进一步分析发现，Mtb-HAg刺激后TB患者γδT细胞中IFN-γ产生细胞的比例显著低于隐感者。4、运用ELISPOT方法检测隐感者（n＝11）和TB（n＝11）患者IFN-γ和IL-17两种细胞因子，隐感者和TB患者比较，经PHA刺激，IFN-γ和IL-17两种细胞因子，TB患者比隐感者产生的要少，两者有明显差异p<0.05。5、HD和TB患者经PBMC培养增殖12天，用Mtb-HAg再刺激用流式细胞术检测γδT细胞IFN-γ+细胞比率。HD和TB患者用或不用Mtb-HAg再刺激检测IFN-γ比较有差异显著性p<0.05。6、不同抗原刺激和极化培养Tγδ17细胞的比较，Mtb-HAg+CK组比Mtb-HAg组明显升高，两组有明显差异（p<0.05），HDMAPP+CK组比HDMAPP组明显升高，两组有明显差异（p<0.05），Mtb-SoAg和Mtb-SoAg+CK组则无差异性。结论：1.Mtb-HAg刺激HD外周血γδT细胞产生IFN-γ的最适时间是20h。2.流式细胞术检测结果表明，Mtb-HAg刺激后隐感者和TB患者的外周γδT细胞中产生IFN-γ的细胞均显著高于αβT细胞。3.流式细胞术和ELISPOT检测均表明，隐感者γδT细胞中产生IFN-γ细胞均比TB患者的高。4.免疫磁珠负选法和ELISPOT检测初步表明隐感者γδT细胞中产生IL-17细胞比TB患者的高。5.HD和TB患者经PBMC培养增殖后，经Mtb-HAg刺激后γδT细胞中产生IFN-γ的细胞明显增多，而产生IL-17细胞经刺激后是下降的。6.HD外周血分离PBMC，Mtb-HAg、磷酸抗原（HDMAPP）激活γδT细胞同时加入含诱导性细胞因子（IL-1β，TGF-β，IL-23），可诱导Tγδ17细胞的分化和增殖，而Mtb-SoAg则不能有效的诱导Tγδ17细胞细胞的分化和增殖。