湖羊瘤胃微生物Fosmid文库中内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

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从湖羊瘤胃Fosmid文库的12,704个克隆中,通过刚果红染色分析获得16个具有内切葡聚糖酶活性的阳性克隆。根据阳性克隆透明圈大小从中选取两个(HF105和HF126)克隆进行序列测定。序列测定结果表明,HF105中含有1个编码内切葡聚糖酶的ORF,编码359个氨基酸,该蛋白含有一个糖基水解酶家族5(GH5)的结构域(pfam00150)。该结构域与Butyrivibrio crossotus DSM2876的内切葡聚糖酶同源性最高,氨基酸序列相似性为72%。HF126中含有1个编码内切葡聚糖酶的ORF,编码759个氨基酸,该蛋白含有三个结构域,分别为CBM_4_9(pfam02018),CelD-N(pfam02927)和GH9(pfam00759)。其中GH9结构域与Butyrivibrio fibrisolvens16/4的GH9基因序列(CBK74409.1)同源性最高,氨基酸序列相似性为85%。   分别将内切葡聚糖酶基因HFec105和HFec126与原核表达载体pET-30a(+)相连接,导入E.coli BL21(DE3)构建基因工程菌。分别经1mM IPTG诱导表达5h和10h后,菌体破碎离心取上清,点样于羧甲基纤维素钠平板,39℃培养3h,经刚果红染色,在平板上可见明显的透明圈,表明表达产物EHFec105以及EHFec126都具有羧甲基纤维素酶活性;进一步用SDS-PAGE和Western blot进行分析检测,EHFec105蛋白分子量约为45kDa与推导的融合蛋白分子量一致,EHFec126蛋白分子量在95-130kDa之间,比推到的融合蛋白分子量89kDa稍大。   破碎上清液经6×His亲和层析纯化,分析纯化酶HFec105和HFec126对于不同底物的水解活性。结果显示,HFec105对CMC底物和β-葡聚糖底物的比活性分别为7.21U/mg和3.89U/mg,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;HFec126对CMC底物和β-葡聚糖底物的比活性分别为3.76U/mg和23.39U/mg,最适反应温度为40℃,最适pH为6.0;而两者对p-NPG、微晶纤维素以及木聚糖均没有水解作用。   将HFec105基因的成熟肽序列与pGAPZαA载体相连接,电击转化毕赤酵母GS115构建重组酵母工程菌GS115-pGAPZαA-HFec105。在YPD培养基中30℃连续发酵120h,分别收集48,72,96和120h表达上清点样于羧甲基纤维素钠平板,39℃培养3h,经刚果红染色,平板上可见明显的透明圈,表明表达产物GSHFec105具有羧甲基纤维素酶活性。在最适反应条件(50℃,pH6.0)下,重组蛋白GSHFec105水解CMC和于β-葡聚糖的比活性分别为8.71U/mg和8.35U/mg。
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